Caracterización de los efectos citoesqueléticos y estructurales de las variantes de INF2 que causan glomerulopatía y neuropatía.

Sep 11, 2023

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 12003 (2023) Citar este artículo

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La glomeruloesclerosis focal y segmentaria (FSGS) es una lesión glomerular común que conduce a una enfermedad renal terminal. La GEFS monogénica se atribuye principalmente a una disminución de la integridad de los podocitos. Las variantes entre los residuos 184 y 245 de INF2, un factor de ensamblaje de actina, producen el fenotipo monogénico FSGS. Mientras tanto, las variantes entre los residuos 57 y 184 causan una enfermedad dual que involucra neuronas periféricas y podocitos (Charcot-Marie-Tooth CMT/FSGS). Para comprender la base molecular de los trastornos INF2, comparamos los efectos estructurales y citoesqueléticos de las variantes de INF2 clasificadas en dos subgrupos: uno (G73D, V108D) causa el fenotipo CMT/FSGS y el otro (T161N, N202S) produce FSGS monogénica. El análisis de dinámica molecular reveló que todas las variantes de INF2 muestran una flexibilidad distinta en comparación con el INF2 de tipo salvaje y podrían afectar la estabilidad de una interacción intramolecular entre sus segmentos N y C-terminales. La inmunocitoquímica de las células que expresan variantes de INF2 mostró menos fibras de actina estresadas y desorganización de las matrices de microtúbulos citoplasmáticos. En particular, las variantes de CMT/FSGS causaron cambios más prominentes en la distribución y fragmentación mitocondrial que las variantes de FSGS y estos cambios se correlacionaron con la gravedad de la alteración del citoesqueleto. Nuestros resultados indican que las variantes de CMT/FSGS están asociadas con defectos celulares globales más graves causados ​​por interacciones alteradas entre citoesqueleto y orgánulos que las variantes de FSGS. Se necesitan más estudios para aclarar las vías específicas de tejido y/o las funciones celulares implicadas en los fenotipos FSGS y CMT

La glomeruloesclerosis focal y segmentaria (FSGS) es una condición clínico-patológica caracterizada por una distribución única de cicatrización glomerular que afecta una parte de la nefrona (focal) y una porción de los mechones capilares (segmentarios)1. Los pacientes con GEFS presentan clínicamente un síndrome nefrótico resistente a esteroides (SRNS) y un deterioro progresivo de la función renal. Hasta la fecha, se ha informado que más de 60 genes están asociados con SRNS2 monogénico. La mayoría de los genes SRNS se expresan en podocitos glomerulares, lo que destaca el papel clave de los podocitos en el mantenimiento de la función de barrera de filtración. Los podocitos generan diafragmas de hendidura entre los procesos del pie enriquecidos con actina y se adaptan al estrés de filtración regulando los cambios en la forma celular mediados por la reorganización dinámica de las redes de actina3.

Las mutaciones en el gen de la forma 2 invertida (INF2) son la causa más prevalente (12-17%) de GEFS autosómica dominante4,5. INF2 pertenece a la subfamilia diáfana de forminas, que actúan como factores de ensamblaje de actina en una variedad de funciones celulares, incluida la migración celular, el transporte de vesículas, la dinámica de los orgánulos y el posicionamiento6. INF2 codifica una proteína multidominio que comprende los dominios de homología de formina central 1 (FH1) y 2 (FH2) flanqueados por el dominio inhibidor diáfano N-terminal (DID) y el dominio autorregulador diáfano C-terminal (DAD). INF2 tiene una capacidad única para acelerar tanto la polimerización como la despolimerización de actina. La actividad de despolimerización se inhibe negativamente mediante la interacción intramolecular entre DID y DAD7. Las mutaciones DID causan trastornos relacionados con INF2 relacionados con la autoinhibición desregulada que hace que la molécula INF2 sea constitutivamente activa. INF2 también interactúa con la familia Rho de pequeñas GTPasas, otros miembros de la familia formina y reguladores celulares para orquestar la organización de estructuras basadas en actina como lamellipodia, filopodia y fibras de estrés6.

Las mutaciones de INF2 se identificaron originalmente en familias dominantes que solo tenían GEFS8. Más de 60 mutaciones de INF relacionadas con enfermedades se asignan exclusivamente al DID codificado por los exones 2 a 49 de INF2,10. En casos raros, en gran medida esporádicos, otras mutaciones de INF2 causan neuropatía periférica asociada con la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (CMT-DIE, MIM#614455), además de FSGS9. Las mutaciones de INF2 que causan FSGS sola o fenotipos dobles FSGS/CMT se segregan en regiones distintivas del DID. Las variantes en la mitad proximal del DID (residuos Leu57 a Glu184) típicamente causan CMT con GEFS de inicio temprano, mientras que aquellas que se localizan en la mitad distal (residuos Glu184 a Leu245) conducen solo a GEFS leve de inicio tardío10. Estas observaciones plantean la cuestión de cómo estas mutaciones INF2 podrían afectar claramente a dos linajes celulares, los podocitos y las células de Schwann. Las mutaciones de INF2 se asocian con desorganización del citoesqueleto y dinámica mitocondrial alterada, tráfico/direccionamiento endosómico e interacciones con mDia, una proteína formina que tiene actividad contrarrestada por INF28,9,11,12,13,14.

Sin embargo, no está clara la razón por la cual la coexistencia de CMT con FSGS está relacionada con mutaciones INF2-DID, que se agrupan exclusivamente en la región proximal del DID.

Para comprender mejor las bases moleculares de los trastornos INF2, comparamos los efectos estructurales y celulares de las variantes de INF2 entre dos subtipos distintos: GEFS única y enfermedades CMT/FSGS duales, en nuestra cohorte de estudio. El análisis estructural y de dinámica molecular reveló que todas las mutaciones examinadas generalmente alteran la estabilidad molecular de las interacciones intermoleculares DID y DAD. Esta alteración probablemente perturba la eficiencia y/o frecuencia de la autoinhibición de INF2. Sin embargo, el modelado no reveló diferencias aparentes en las características dinámicas estructurales entre los dos subgrupos fenotípicos. La inmunocitoquímica de las células que expresan variantes de INF2 permitió la visualización de distintos efectos citoesqueléticos entre los subgrupos CMT/FSGS y FSGS. Las variantes de CMT/FSGS tenían una arquitectura desorganizada tanto de actina como de microtúbulos, que son los principales componentes celulares afectados y son fundamentalmente los mismos que los de las variantes de FSGS. Sin embargo, las variantes CMT/FSGS causan una desorganización citoesquelética más prominente que las variantes FSGS y, a su vez, tienen un efecto más grave sobre el tamaño, la forma y la distribución de las mitocondrias.

Estudiamos diez familias, cinco de las cuales siguieron un patrón de transmisión dominante (Fig. 1).

Árboles genealógicos con mutaciones en INF2 que muestran fenotipos duales de CMT y FSGS o de FSGS único. Se muestra la segregación de variantes de INF2 para cada familia. Los cuadrados y círculos indican sujetos masculinos y femeninos, respectivamente. Las barras indican sujetos fallecidos y las flechas indican pacientes índice. GEFS: glomeruloesclerosis focal y segmentaria, CMT: enfermedad de Charcot-Marie-Tooth. E: examen, PE: examen físico, u, poco informativo; WT: tipo salvaje

Las características clínicas de los 10 pacientes índice con mutaciones INF2 se resumen en la Tabla 1. Seis individuos exhibieron FSGS solo, mientras que los otros cinco individuos tenían fenotipos dobles CMT y FSGS (CMT/FSGS). De acuerdo con informes anteriores4,5,8,9, las manifestaciones clínicas de personas con GEFS sola típicamente incluían proteinuria, que iba de moderada a nefrótica, que surgió desde la adolescencia temprana hasta la edad adulta. Algunos individuos presentaban hematuria microscópica e hipertensión. El inicio de la proteinuria en el subgrupo de GEFS sola se manifestó en diferentes momentos desde la niñez hasta la edad adulta (rango de 8 a 30 años, edad promedio de 16 años) y, en general, progresó a enfermedad renal terminal (ESRD, por sus siglas en inglés) en el tercer al cuarto década de la vida (Tabla complementaria S1). En particular, las personas con CMT/FSGS tuvieron proteinuria antes (rango de 6 a 14 años, mediana de 11 años) y progresaron más rápidamente a ESRD (rango de 12 a 17 años, mediana de 15 años) que aquellos con FSGS solo (rango 13 a 36 años, mediana 24 años) (Tabla complementaria S1, S2). El análisis de Kaplan-Meier confirmó que los individuos en el subgrupo CMT/FSGS manifestaron un inicio más temprano de SRNS y progresaron más rápido a ERSD (P <0,01) (Figura complementaria S1). La microscopía óptica de muestras de biopsia renal de los dos subgrupos mostró una variedad de hallazgos histológicos, desde cambios mínimos hasta FSGS. Los resultados histológicos podrían subtipificarse en gran medida como “FSGS, no especificada de otra manera (NOS)”1. En algunos pacientes con enfermedad avanzada, sólo se encontró esclerosis glomerular global difusa. Un estudio de inmunofluorescencia reveló sólo depósitos inespecíficos de IgM y C3, con una excepción: a un paciente índice (caso 4, II-1) se le diagnosticó inicialmente nefropatía por IgA. La microscopía electrónica mostró borramiento del proceso del pie de los podocitos en ausencia de deposiciones densas en electrones.

Los cinco individuos con CMT/FSGS experimentaron dificultad para caminar con atrofia y debilidad de los músculos de las extremidades inferiores a partir de edades comprendidas entre los 10 y los 15 años. Los síntomas neurológicos se manifestaron por primera vez a edades similares a las de la proteinuria (Tabla complementaria S2). La neuropatía periférica afectó preferentemente la función motora en las extremidades inferiores distales.

Los estudios electrofisiológicos revelaron velocidades de conducción del nervio mediano (MCV) en el rango intermedio (25 a 45 m por segundo)15 para dos individuos, y los otros tres exhibieron una característica desmielinizante predominante MCV <20 m por segundo sin perfil excitable o cebolla multicapa. formación de bulbos. En un caso se observó pérdida de audición (caso 10).

Encontramos 10 variantes heterocigotas de INF2 sin sentido en seis individuos con FSGS familiar y cuatro esporádicos. Las 10 variantes se localizaron en residuos altamente conservados en los exones 2 a 4 que codifican INF2 DID (Figura complementaria S2). El análisis in silico predijo que estas mutaciones son ciertamente nocivas. Además, estas variantes no estaban presentes en 10 000 individuos de control sanos de la misma etnia (jMorp) o en una base de datos de poblaciones grandes que contenía más de 246 000 cromosomas (gnomAD) (Tabla 1). En particular, las mutaciones que causan GEFS por sí solas se localizan dentro de la mitad distal del TID. Por el contrario, aquellos asociados con el fenotipo dual CMT/FSGS se distribuyen en la mitad N-terminal proximal del TID (Fig. 2). Las mutaciones p.T161N y p.L162P ocurrieron en una región fronteriza que separa los grupos de mutaciones de CMT/FSGS del subgrupo FSGS5.

Ubicaciones de variantes en la estructura del dominio INF2. Se muestra la distribución de variantes en los dominios funcionales de INF2. Se encontraron variantes en el exón 2 en individuos con un fenotipo dual de enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (CMT) y GEFS, mientras que las del exón 3 y el exón 4 se identificaron en pacientes con GEFS sola. INF2 es una gran proteína multidominio compuesta de tres dominios funcionales: dominio inhibidor diáfano (DID, naranja), dominios de homología de formina (FH) FH1 y FH2 (rojo y verde) y dominio autorregulador diáfano (DAD, azul). El DID interactúa con el DAD dentro de la misma molécula (autoinhibición intramolecular), así como con otros reguladores de actina (p. ej., GTPasa pequeña y mDia). Los dominios FH median tanto en la polimerización como en la despolimerización de actina. Las posiciones de los dominios se ajustan a UniprotKB-Q27J81. WH2: homología WASP 2; mDia: forma 1 relacionada con el diáfano de mamíferos.

Para evaluar los impactos de las mutaciones en la estructura del INF2 humano, primero modelamos las variantes patogénicas en el DID utilizando la estructura cristalina del complejo mDia1 DID/DAD de ratón como base16,17. Las cadenas laterales de los residuos hidrófobos del dominio DAD parecieron interactuar con los bolsillos de unión DID, que están formados por las hélices α 7, α10 y α13 de las repeticiones de armadillo (ARM) (Fig. 3, Figura complementaria S2, S3). Este modelo estructural fue consistente con el derivado del programa AlphaFold2 basado en aprendizaje profundo 18 (Figura complementaria S4). En este modelo, las variantes de CMT/FSGS se mapearon cerca del núcleo central del bolsillo hidrofóbico de unión a DAD, mientras que las variantes de FSGS ocurrieron en porciones más externas.

Modelado estructural del INF2 humano. Una estructura 3D de INF2 humano modelada a partir de la estructura cristalina compleja mDia1 DID-DAD (PDB 2F31) 16 utilizando el programa Rosetta. (A) Las ubicaciones de diez variantes patógenas en el DID se ilustran como diagramas de cinta; Azul: L69P, G73D (G73V), Naranja: V108D, Magenta: G157R, T161N, L162P, Rosa: N202S, R218W, E220K. Según este modelo, se predice que la hélice α del DAD N-terminal (turquesa) entrará en contacto con el bolsillo central del DID. Las cadenas laterales de residuos seleccionados implicados en las interacciones DID/DAD se muestran en forma de barra: N110 e Y153 en DID, E969, V972 y L976 en DAD. Las hélices α centrales, α7, α10, α13, de la segunda, tercera y cuarta repeticiones de armadillo respectivamente, crean los bolsillos de unión DID. (B) Interacción central DID-DAD. El DID se muestra como una representación de superficie girada horizontalmente 180˚. Se predice que los residuos E969, V972, L976 en el DAD N-terminal harán contacto directo con los socios expuestos en la superficie N110, Y153 en el bolsillo de unión hidrófobo de DID.

A continuación, evaluamos las interacciones DID/DAD en variantes patógenas de INF2 mediante modelado de estructuras. Los gráficos de interacción PDBsum revelaron que la interfaz DID-DAD de las variantes patógenas de INF2 tiene cambios apreciables tanto en el emparejamiento de aminoácidos como en el número de enlaces de hidrógeno en relación con el tipo salvaje (Figura complementaria S5). Sin embargo, el área de interfaz y la energía libre de disolvente (ΔG) no difirieron significativamente y no parecen alterar la afinidad de unión general de la interacción DID/DAD. (Tabla complementaria S3)19. Los análisis de modelos sugieren que los efectos estructurales de las variantes de INF2 pueden ser cambios sutiles en el patrón de interacción y la necesidad de evaluar su dinámica molecular.

A continuación, investigamos los efectos de las mutaciones sin sentido de INF2 sobre la flexibilidad dinámica y la estabilidad del complejo DID-DAD. La dinámica molecular de las proteínas INF2 se comparó entre las variantes de tipo salvaje y cinco patogénicas mediante el modelado comparativo utilizando el programa Rosetta y la simulación de dinámica molecular (MD) utilizando el programa GROMACS. Primero accedimos a la estabilidad estructural general del complejo DID-DAD de tipo salvaje analizando las trayectorias de desviación cuadrática media (RMSD) de sus átomos principales durante la simulación de 500 ns. El RMSD aumentó durante los 50 a 100 ns iniciales hasta aproximadamente 0,5 nm y alcanzó una meseta hasta el final del período de simulación de 500 ns (Fig. 4). Cinco variantes de INF2 mostraron trayectorias de RMSD que se equilibraron entre el período de 50 ns a 100 ns similar al tipo salvaje, con la excepción de T161N que muestra un aumento gradual de RMSD que se estabilizó alrededor de 200 ns. Cuando se compararon las trayectorias en estado estacionario, las variantes exhibieron un grado variable de cambios en el RMSD promedio general: la variante G73D mostró el valor RMSD promedio más grande (0,71 nm frente a 0,52 nm de tipo salvaje), mientras que L69P exhibió un nivel mínimamente aumentado en comparación con el tipo salvaje (0,55 nm) (Tabla complementaria S4). Por el contrario, los otros tres (T161N, R218W, E220K) mostraron una disminución sutil en RMSD (0,44–0,46 nm) en relación con el tipo salvaje. La variación en el RMSD global de las variantes de INF2 sugiere que los cambios conformacionales pueden tener lugar en el complejo proteico a lo largo de la simulación.

Comparación de la dinámica molecular entre INF2 de tipo salvaje y variantes mediante gráficos de desviación cuadrática media (RMSD). Los valores de RMSD (nm) se trazan sobre las simulaciones de MD de 500 ns (ns) asumiendo una solución acuosa. Una comparación por pares de las trayectorias entre el INF2 de tipo salvaje y las variantes revela que las variantes que causan enfermedades tienen una flexibilidad distinta del complejo autoinhibidor DID-DAD en comparación con el INF2 de tipo salvaje (WT). El RMSD del WT aumenta durante los 50 a 100 ns iniciales hasta 0,5 nm y alcanza una meseta hasta el final del período de simulación de 500 ns. En estado estacionario, la variante G73D tiene una dinámica molecular más alta, mientras que L69P muestra un cambio mínimo comparable al WT. Por el contrario, las otras tres variantes (T161N, R218W y E220K) muestran una disminución sutil en RMSD que el WT.

Para obtener más información detrás de la estabilidad/flexibilidad alterada del complejo DID-DAD, estimamos la fluctuación de los residuos de aminoácidos individuales dentro de los complejos midiendo la fluctuación cuadrática media (RMSF) para los átomos de la columna vertebral de INF2 de tipo salvaje y variantes. RMSF estima la desviación promedio de cada residuo de la posición de referencia dentro de las estructuras minimizadas durante el tiempo de simulación MD. El análisis RMSF del complejo INF2 DID-DAD de tipo salvaje reveló fluctuaciones notables en los cuatro grupos: dos regiones de mayor fluctuación que abarcan los residuos 80–96 y 152–164 (desviación > 0,3 nm de las posiciones de referencia), mientras que las otras dos moderadamente regiones fluctuantes en los residuos 180–194 y 208–220 (alrededor de 0,1–0,2 nm) (Fig. 5). Estos cuatro grupos con RMSF más alto corresponden a los segmentos de bucle que conectan las hélices α del dominio DID, cuya conformación se considera crítica para la interacción con el dominio DAD (Figura complementaria S2—S6) 16.

Comparación de la dinámica molecular entre INF2 de tipo salvaje y variantes mediante gráficos de fluctuación cuadrática media (RMSF). Las puntuaciones de RMSF se muestran por residuo del dominio INF2-DID según las simulaciones de Cα MD durante 500 ns, suponiendo una solución acuosa. Utilizamos las trayectorias de simulación de los últimos 400 ns, el intervalo de tiempo en el que la estructura se ha estabilizado. Una comparación por pares de trayectorias entre el INF2 de tipo salvaje (WT) y las variantes patógenas muestra las fluctuaciones residuales alteradas en el dominio DID. Las regiones de fluctuación más alta (80–96, 152–164) y moderada-alta (180–194, 204–220) en las variantes WT y patógenas se resaltan con un fondo sombreado de color rosa claro y azul claro, respectivamente. El primer pico de fluctuación en los residuos 80–96 aumenta (L69P), se amplía con la división (T161N), disminuye (G73D, E220K) y no cambia (R218W). El segundo pico de fluctuación en los residuos 152–164 se pierde para cuatro variantes (G73D, T161N, R218W, E220K), mientras que se conserva para L69P. La estructura secundaria de consenso se muestra esquemáticamente con hélices α (verde) y bucles (rosa).

La comparación de los datos de RMSF entre INF2 de tipo salvaje y las variantes reveló variaciones en la dinámica de los residuos en el dominio DID para las variantes patógenas. Primero, en los residuos 80–96 del primer grupo, la variante L69P mostró una mayor amplitud, mientras que T161N mostró un ensanchamiento en el pico de las fluctuaciones. Las otras dos variantes (G73D y E220K) mostraron una leve disminución de la amplitud de la fluctuación. El restante (R218W) exhibió diferencias sutiles o indistinguibles para este pico. En segundo lugar, en los residuos 152-160 del segundo grupo, todas las variantes (G73D, T161N, R218W, E220K) perdieron el pico de fluctuación normal, con excepción de la variante L69P que preserva la flexibilidad en esta región. Nuestras observaciones indican que las mutaciones patogénicas de INF2 podrían causar cambios variables en la flexibilidad conformacional del dominio DID.

Luego evaluamos las interacciones de residuos en la interfaz DID-DAD de las variantes de INF2. Primero comparamos la flexibilidad del residuo de Glu968 en la interfaz DID-DAD superponiendo dos instantáneas de la estructura dinámica INF2 simulada a 0 ns y 500 ns, la última de las cuales representó el último cuadro de trayectorias que alcanzaron su estado estable de dinámica. Las imágenes superpuestas mostraron que los residuos de Glu968 en la interfaz tienen una movilidad variable entre las variantes patógenas, en comparación con el tipo salvaje (Fig. 6).

Comparación de la movilidad de residuos en la interfaz DID-DAD entre INF2 de tipo salvaje y cinco variantes patogénicas. La dinámica molecular de las estructuras humanas de INF2 se simula utilizando el programa GROMACS, asumiendo que la proteína está solvatada en agua con sal. Las imágenes de estructuras dinámicas se capturan con VMD (http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/) y se comparan entre INF2 (WT) de tipo salvaje con variantes patógenas. El residuo de DAD Glu968, que participa en la interacción DID-DAD, se indica como un marcador de seguimiento de índice (flecha, en t = 0 ns; puntas de flecha, en t = 500 ns). (A) Movilidad del residuo de Glu968 en INF2 de tipo salvaje. Se muestran imágenes superpuestas a 0 ns (verde) y 500 ns (cian). La posición de Glu968 a 500 ns (punta de flecha, rojo) se desvía de la de la referencia en el tiempo 0 ns (flecha amarilla), lo que indica que el residuo de Glu 968 de INF2 de tipo salvaje es móvil durante la simulación de MD de 500 ns. (B – E) Movilidad del residuo de Glu968 en variantes patógenas de INF2. Las estructuras dinámicas de las variantes de tipo salvaje (cian) e INF2 (L69P, G73D, T161N, R218W, E220K, magenta) se simulan a 500 ns y se muestran las imágenes superpuestas. Para las cinco variantes patógenas de INF2, las posiciones de Glu968 a 500 ns (punta de flecha, amarillo) están desplazadas de la ubicación de referencia de WT (punta de flecha, rojo), lo que indica que las variantes patógenas tienen una movilidad alterada en la interfaz DID-DAD en comparación con el peso.

Luego evaluamos los cambios en la dinámica del par de residuos en la interfaz DID-DAD. Primero comparamos la evolución temporal de la distancia entre la cadena lateral de los átomos de Cα de la columna vertebral en Gly62 y Glu968 en la interfaz DID-DAD (Figura complementaria S7). Las distancias de los pares de residuos se trazaron durante la simulación de 500 ns, tiempo suficiente para lograr una conformación estable. El gráfico de evolución temporal reveló que las variantes patógenas se dividen en tres clases con respecto a sus trayectorias: una variante, L69P, mostró la distancia promedio entre residuos más larga entre Gly62 y Glu968 que el tipo salvaje (1,32 frente a 0,67 nm, Tabla complementaria S4), mientras que los otros dos (G73D, E220K) exhibieron una distancia igual o menor en comparación con el tipo salvaje (0,65 y 0,52 nm, respectivamente). Los dos restantes, T161N y R218W, mostraron un nivel de distancia intermedio que fluctúa con el tiempo (promedio 0,70, 0,73 nm respectivamente).

A continuación, comparamos la variación en los contactos de residuos en la interfaz DID-DAD en un total de 500 estructuras simuladas capturadas cada 1 ns durante la simulación de 500 ns-MD entre las variantes de tipo salvaje e INF2 midiendo la frecuencia de disociación. La disociación se define como la distancia entre las cadenas laterales de Gly62 y Glu968 que se desvía más de 3 a 5 Å de la posición de referencia (a 0 ns) durante la simulación de 500 ns. La variante L69P mostró la disociación más frecuente (77% frente a 13% para el tipo salvaje), mientras que G73D tuvo, por el contrario, el valor más bajo (0%). T161N y R218W exhibieron una tasa de disociación más alta de leve a moderada (37 % y 19 % respectivamente), y E220K mostró una frecuencia ligeramente menor (5 %) en comparación con el tipo salvaje (13 %) (Figura complementaria S8, S9).

En conjunto, nuestras simulaciones MD de las variantes patogénicas revelan cambios variables en la distancia promedio entre residuos y sus fluctuaciones en la interfaz DID-DAD del complejo autoinhibitorio. Las observaciones sugieren que las mutaciones podrían perturbar los contactos residuales nativos, lo que llevaría a una estructura general menos estable.

Luego evaluamos los efectos celulares de las variantes de INF2 examinando la distribución subcelular de las proteínas INF2 y las redes de actina en células HeLa y COS-7 transfectadas con variantes de INF2 marcadas con cMyc (Figura complementaria S10). En las células HeLa, el INF2 de tipo salvaje tenía una localización difusa en todo el citoplasma con un patrón reticular fino localizado en el RE y acumulación perinuclear en Golgi8,21. Las fibras de estrés de actina formaron una gruesa matriz paralela que abarcaba las células y era similar a la de las células no transfectadas22,23.

Por el contrario, las células HeLa que expresan variantes de CMT/FSGS (G73D, V108D) exhibieron una expresión subcelular de INF2 alterada que se distribuyó de manera desigual en un patrón granular grueso que tenía menos grupos de Golgi perinucleares (Fig. 7). En particular, las células HeLa que expresan variantes de CMT/FSGS (G73D, V108D) ocasionalmente se alargaban a lo largo del eje longitudinal, lo que recuerda a las células que expresan mDia120 constitutivamente activo. En estas células de forma fusiforme, algunos puntos INF2 se acumularon en el polo periférico (Fig. 7). El análisis cuantitativo mostró que las células que expresan variantes de CMT/FSGS tienen significativamente menos filamentos de fibra de estrés de actina en relación con las células que expresan INF2 de tipo salvaje (Fig. 8). Las células COS-7 transfectadas que expresan variantes de CMT/FSGS también mostraron una distribución subcelular INF2 aberrante con una dispersión de Golgi que se asemeja a la de las células HeLa transfectadas y ocasionalmente exhibieron una propagación celular prominente (Figura complementaria S11). La transfección con INF2 en podocitos de ratón mostró una distribución subcelular y una red de actina, esencialmente similar a las células HeLa y COS-7 (Figura complementaria S12).

Expresión de variantes de INF2 que causan fenotipos de FSGS simple o dual CMT-FSGS en células HeLa (A) Localización subcelular de variantes de INF2 y red de actina. Se transfectaron INF2 de tipo salvaje marcado con cMyc y variantes patógenas en células HeLa. A las 8 h después de la transfección, las células se fijaron y se tiñeron con anticuerpo anti-cMyc (verde) y faloidina (blanco). Dos variantes (G73D, V108D) causan un fenotipo dual CMT/FSGS, mientras que las otras dos (T161N, N202S) conducen a FSGS sola. El número de filamentos de estrés de actina se redujo notablemente en las células que expresaban la variante G73D, V108D en comparación con aquellas que expresaban la variante T161N, N202S. Las líneas discontinuas resaltan el contorno de la celda. Barras = 10 μm. (B) Análisis de transferencia Western de variantes de INF2. La expresión de la proteína INF2 en células HeLa que expresan INF2 de tipo salvaje marcado con cMyc o las variantes G73D, V108D o T161N y N202S se analizó mediante transferencia Western. Las proteínas variantes de FSGS (T161N, N202S) fueron menos abundantes que la proteína de tipo salvaje. Las variantes de CMT/FSGS (V108D, G73D) fueron apenas detectables, lo que sugiere que esta variante puede ser más vulnerable a la degradación. Después del paso de extracción, se volvió a sondear el control interno de β-tubulina en la membrana idéntica con el mismo tiempo de exposición que la detección de INF2 (5 min). Las transferencias/geles originales se presentan en la Figura complementaria S14.

Las variantes de INF2 alteran las redes de actina en las células HeLa que expresan variantes de INF2 patógenas o de tipo salvaje. (A) Imágenes representativas de cuatro subgrupos de patrones de fibras de estrés de actina. Las imágenes confocales se subdividieron según estudio previo22,23. Clase 1: cables pesados ​​y distintos cruzan > 90% del área central de la celda; Clase 2: al menos dos cables pesados ​​y distintos ingresan a la mitad central de la celda y el área restante se llena con cables finos; Clase 3: las células tienen sólo cables finos; y Clase 4: no se detectan cables en la zona central. Barras de escala: 10 µm. (B) Histograma que muestra una distribución proporcional de los fenotipos de actina F. Dos investigadores independientes inspeccionaron visualmente y calificaron las imágenes de inmunofluorescencia (n = 100). Las distribuciones proporcionales de las categorías de fenotipo de actina fueron significativamente diferentes entre INF2 (WT) de tipo salvaje y cada variante, y entre los subgrupos de variantes que causan FSGS y CMT/FSGS. Las diferencias entre subgrupos se analizaron mediante la prueba exacta de Fisher con corrección de pruebas múltiples: no significativa (ns) o significativa (asteriscos).

Las células HeLa que expresan variantes asociadas con FSGS sola (T161N, N202S) conservaron el patrón ER difuso con acumulación en Golgi similar al INF2 de tipo salvaje. Sin embargo, estas células tenían menos fibras de estrés de actina que aquellas que expresaban INF2 de tipo salvaje, lo que indica que las variantes de FSGS tienen una desregulación citoesquelética que se encuentra entre la observada para las variantes de tipo salvaje y CMT/FSGS (Figs. 7, 8 y 9). La gravedad de la desorganización de la actina en las células que expresan la variante FSGS INF2 se verificó mediante clasificación automatizada de imágenes utilizando la herramienta de aprendizaje profundo ALEXNET. Después de entrenar la red neuronal en un conjunto de datos representativo etiquetado manualmente (normal frente a menos cables), las imágenes de prueba se procesaron y clasificaron automáticamente en dos categorías. Las células que expresaban T161N se clasificaron principalmente en la categoría de "menos fibras de estrés", mientras que aquellas que expresaban INF2 de tipo salvaje se consideraron en general como si tuvieran un patrón normal (p <0,001, Figura complementaria S13).

Localización subcelular de INF2 y distribución de mitocondrias y actina en células HeLa que expresan variantes de tipo salvaje o INF2. Las células se marcaron con MitoTracker 24 h después de la transfección con construcciones INF2 marcadas con cMyc y luego se fijaron con paraformaldehído al 4%. Las células se tiñeron triplemente con anticuerpo c-Myc (Alexa 488), faloidina (Alexa 647) y MitoTracker (Alexa 555). Las células que expresan la variante de tipo salvaje y FSGS (T161N, N202S) mostraron un patrón ER reticular fino y difuso con grupos de Golgi, mientras que aquellas que expresan la variante CMT (G73D, V108D) exhibieron un patrón puntiforme grueso con acumulación periférica (flechas). La reducción en el número de fibras de estrés de actina fue más pronunciada en las células que expresaban variantes de CMT/FSGS en comparación con aquellas que expresaban variantes de FSGS. En las células que expresan INF2 de tipo salvaje, las mitocondrias se distribuyeron uniformemente en la región perinuclear. Por el contrario, todas las variantes patogénicas provocaron que las mitocondrias se localizaran incorrectamente en la periferia celular (puntas de flecha). El grado de localización errónea fue más grave en las células que expresaban variantes de CMT/FSGS en comparación con aquellas que expresaban variantes de FSGS. Las células que expresan la variante T161N mostraron una configuración intermedia, con una distribución casi igual de patrones perinucleares y periféricos. Barras de escala: 10 μm.

El análisis de transferencia Western de lisados ​​de células HeLa que expresan INF2 de tipo salvaje reveló una única banda principal que tenía una masa molecular aparente de 170 kDa. Las proteínas eran menos abundantes para las variantes que causan FSGS (T161N, N202S) que para las de tipo salvaje. Además, en las células que expresan las variantes asociadas con CMT/FSGS (G73D, V108D), los niveles de proteína INF2 eran apenas detectables, lo que sugiere que estas proteínas variantes, particularmente del subtipo CMT/FSGS, eran más lábiles y, por lo tanto, más susceptibles a la degradación que las salvajes. -tipo (Fig. 7B, Figura complementaria S14). En conjunto, las células que expresan variantes de CMT/FSGS mostraron alteraciones más prominentes en la organización de la actina, la forma celular y la disposición de los orgánulos (es decir, patrón alterado del RE con dispersión de Golgi) que las variantes de FSGS, lo que probablemente también refleja los defectos más pronunciados en su distribución subcelular. como los cambios en la estabilidad de la proteína INF2.

A continuación, examinamos la morfología y distribución de las mitocondrias en células HeLa fijas que expresan INF2 etiquetado con c-Myc. Las células que expresan variantes de tipo FSGS (N202S) tenían mitocondrias que se distribuían principalmente en la región perinuclear en un patrón similar al observado en las células que expresan INF2 de tipo salvaje (Fig. 9). Por el contrario, las células que expresan variantes de CMT/FSGS (G73D y V108D) mostraron un cambio prominente en la distribución de las mitocondrias, con una tendencia hacia la localización periférica con alineación longitudinal y paralela de algunas mitocondrias a lo largo de los filamentos de actina desorganizados (Fig. 9). Las células que expresan la variante T161N exhibieron un fenotipo intermedio en términos de forma y distribución subcelular en el que las mitocondrias tenían una localización predominantemente perinuclear con cierto enriquecimiento aberrante en la periferia celular (Fig. 9).

A continuación, examinamos la morfología de las mitocondrias en células vivas transfectadas con variantes de INF2 utilizando la variante T161N como variante patogénica representativa y el etiquetado de la red mitocondrial en células vivas utilizando MitoTracker. En las células que expresan INF2 de tipo salvaje, las mitocondrias tenían un patrón tubular normal con acumulación perinuclear. Por el contrario, la expresión de variantes T161N alteró la morfología mitocondrial del patrón tubular normal a un patrón globular con una apariencia fragmentada (Fig. 10, Figura complementaria S15, 16). Además, algunas mitocondrias estaban distribuidas de manera aberrante en la periferia celular (Figs. 9, 11). El análisis cuantitativo indicó que la longitud promedio de las mitocondrias en las células que expresan T161N disminuyó en un factor de 2,76 en comparación con el tipo salvaje, lo que sugiere que esta variante patógena aumenta la fragmentación de las mitocondrias (Fig. 10, Figura complementaria S15, 16). Estas observaciones indican que la variante INF2-T161N altera el tamaño, la forma y la distribución de las mitocondrias mediante la desorganización del citoesqueleto.

Morfología de las mitocondrias en células HeLa que expresan la variante INF2 de tipo salvaje o T161N. (A) Morfología de las mitocondrias en células vivas. Las células se marcaron con MitoTracker 8 h después de la transfección con INF2 de tipo salvaje marcado con GFP o la variante T161N. Las imágenes se capturaron utilizando filtros a 488 nm (GFP, verde) y 555 nm (MitoTracker, rojo). Las mitocondrias estaban más fragmentadas en las células que expresaban la variante T161N (puntas de flecha) y mostraban un patrón mayoritariamente tubular en comparación con las células que expresaban la variante salvaje (flechas). Los asteriscos indican una mala distribución en la periferia celular. Barras de escala: 5 µm. (B) Cuantificación de la longitud mitocondrial. La longitud de 10 mitocondrias por área elegida al azar en el citoplasma se midió utilizando ImageJ (n = 20 áreas para cada grupo). Las células que expresan la variante T161N INF2 tuvieron una reducción de 2,76 veces en la longitud de las mitocondrias. Los datos se muestran como media ± SEM. (C) Cuantificación del número de mitocondrias por célula. El número de mitocondrias se analizó mediante la herramienta Count and Measure con el programa Cellsens (n ​​= 15 células para cada grupo). Las células que expresaban la variante T161N INF2 tenían un número significativamente mayor de mitocondrias que las que expresaban INF2 de tipo salvaje. El número de mitocondrias en las células de control transfectadas y no transfectadas de tipo salvaje no fue una diferencia significativa (p = 0,06). Los datos se muestran como media ± SEM.

Morfología y distribución de las mitocondrias en células COS-7 que expresan la variante INF2 de tipo salvaje o T161N. (A) Cambios en las mitocondrias en células que expresan INF2. El INF2 de tipo salvaje marcado con cMyc o la variante T161N se transfectaron en células COS-7, que se fijaron y marcaron con anticuerpo anti c-Myc (verde) y MitoTracker (rojo) 8 h después de la transfección. Las células que expresan la variante T161N exhibieron una fragmentación y distribución errónea de las mitocondrias más frecuente en la periferia celular (flechas); Se observó cierta acumulación en los procesos celulares (puntas de flecha). Por el contrario, las células que expresan INF2 de tipo salvaje mostraron estructuras tubulares que se acumulaban preferentemente en la región perinuclear. Las líneas discontinuas indican el contorno de las células no transfectadas. Barras de escala: 10 μm. (B) Perfil geométrico de la distribución de mitocondrias en células que expresan INF2. Los perfiles de intensidad de las mitocondrias a lo largo de las líneas blancas indicadas en el panel A se trazaron con ImageJ. El eje Y representa la intensidad de las señales mitocondriales (valor gris), mientras que los ejes X y Z representan el eje celular y la propagación, respectivamente. Se analizaron las áreas marcadas por la línea de puntos blanca. Las células que expresan variantes de tipo CMT/FSGS (G73D) mostraron una distribución errónea periférica prominente de las mitocondrias; la falta de señales en la zona central se indica con el asterisco. Las células que expresaban variantes de T161N exhibieron un patrón intermedio de mala distribución en el que estaban presentes tanto una localización perinuclear normal como una mala distribución ocasional hacia la periferia celular.

A continuación, comparamos la disposición de los microtúbulos de las células HeLa que expresan INF2 de tipo salvaje marcado con GFP N-terminal y variantes patógenas. En las células no transfectadas y en aquellas que expresan INF2 de tipo salvaje, los microtúbulos generaron una matriz radial que se extendió uniformemente por todo el citoplasma (clase 1, en la Fig. 12). Este patrón sugiere una nucleación y polimerización normales desde un centro organizador de microtúbulos perinucleares. Mientras tanto, las células que expresan variantes patógenas de INF2 exhibieron una red de microtúbulos desorganizada. Las células que expresan la variante T161N mostraron un patrón mixto e irregular de desorganización de microtúbulos en el que la corteza estaba llena de haces de microtúbulos gruesos alineados longitudinalmente y una distribución escasa de conjuntos de microtúbulos delgados e irradiados normales (clase 2). Las células que expresan la variante G73D generalmente exhibían una desregulación global en la que la mayoría de los microtúbulos estaban desorganizados como haces alineados paralelos al eje largo de la célula y carecían de polaridad (clase 3).

Matriz de microtúbulos y distribución de mitocondrias en células HeLa que expresan variantes de INF2. Las células HeLa transfectadas con variantes INF2, T161N y G73D de tipo salvaje marcadas con eGFP se tiñeron con MitoTracker (rojo) y anti-α-tubulina (blanco). El contorno de las células transfectadas se indica mediante líneas de puntos. (A) Distribución subcelular de mitocondrias y microtúbulos. Las mitocondrias en las células que expresan la variante T161N (punta de flecha) estaban mal distribuidas en la periferia celular, mientras que las de las células de tipo salvaje se ubicaban predominantemente en la región perinuclear. En las células que expresan INF2 de tipo salvaje, los microtúbulos se organizaron en un patrón radiante difuso. Las células que expresaban las variantes T161N y G73D tenían diversos grados de alineación aberrante y, en particular, tenían haces paralelos. Barras = 20 μm. (B) Los tres subtipos se clasifican según los siguientes criterios: Clase 1: subtipo normal: orientado en una matriz que irradia desde el área del centrosoma cerca de los núcleos (subtipo normal). La flecha indica el centro organizador de microtúbulos. Clase 2: subtipo intermedio: algunas regiones del citoplasma están ocupadas por microtúbulos dispuestos en paralelo, mientras que el área restante está llena de una matriz radiante normal; y Clase 3: subtipo desorganizado: los microtúbulos están globalmente alineados en paralelo (formación de haces) a lo largo del eje longitudinal de las células. El diagrama muestra una distribución proporcional de estos fenotipos en las células HeLa. Se clasificaron células de tres transfecciones independientes (n = 200 células).

El doble marcaje de mitocondrias mostró que, en marcado contraste con la localización perinuclear predominante observada en células no transfectadas y que expresan INF2 de tipo salvaje, las mitocondrias en células que expresan la variante G73D o T161N INF2 tenían mitocondrias que estaban mal distribuidas en la periferia celular, lo que sugiere defectos. Tráfico de mitocondrias a lo largo de microtúbulos.

La clasificación cuantitativa de los patrones morfológicos en tres subgrupos reveló que aproximadamente el 70% de las células tanto de tipo salvaje como no transfectadas exhibían microtúbulos que irradiaban aleatoriamente (clase 1). Por el contrario, alrededor del 60% de las células que expresan la variante T161N exhibieron un patrón de microtúbulos parcialmente desorganizado (clase 2), mientras que alrededor del 70% de las células que expresan la variante G73D mostraron un desarreglo global de los microtúbulos (clase 3, n = 200 células para cada grupo). Figura 12). Las observaciones indicaron que las variantes patógenas de INF2 promovieron una arquitectura de microtúbulos y una distribución mitocondrial desorganizadas, y las variantes CMT/FSGS causan una desorganización más grave que las variantes FSGS.

En el presente estudio, exploramos los mecanismos moleculares por los cuales las mutaciones INF2-DID entre los residuos 57 y 184 causan dos subconjuntos de trastornos, CMT y FSGS. El modelado estructural y la simulación de dinámica molecular no revelaron diferencias consistentes entre las variantes asociadas con los dos fenotipos distintos. Nuestros estudios de expresión revelaron que tanto las variantes CMT/FSGS como FSGS comparten un modo de acción común que afecta principalmente a la organización de los microtúbulos de actina. Esta desorganización del citoesqueleto perturba las características celulares globales, como la forma y la posición de los orgánulos. Las variantes asociadas con CMT/FSGS tienen un efecto citoesquelético más prominente que las variantes asociadas con FSGS sola y, por lo tanto, a su vez confieren defectos mitocondriales más graves. En particular, los defectos mitocondriales son una consecuencia crítica de la desregulación citoesquelética en los trastornos INF2, dado que tales anomalías se observan con frecuencia en otros subtipos clínicos de CMT, así como en la GEFS2,3,19. Las ubicaciones de nuestras mutaciones INF2 son consistentes con los puntos calientes informados, donde las variantes únicas que causan FSGS se ubican dentro de la mitad distal del DID, mientras que aquellas para el fenotipo dual CMT/FSGS se distribuyen en la mitad N-terminal proximal del DID. Sin embargo, catálogos recientes de mutaciones no han revelado diferencias consistentes en las ubicaciones entre los dos subtipos clínicos (Tabla complementaria S5, S6). Por ejemplo, existe una considerable variabilidad intrafamiliar y/o interfamiliar de las mutaciones INF2. Además, se ha informado que los pacientes con variantes de INF2 que afectan el dominio DID proximal (residuo Arg91, Val102, Cys104) presentan CMT solo o CMT con glomerulopatía mínima19 (Tabla complementaria S6). Así, en la mayoría de los trastornos INF2, las enfermedades renales son un denominador común en el fenotipo clínico. Sin embargo, es necesario realizar más estudios de correlación genotipo-fenotipo para verificar la hipótesis de que los podocitos podrían ser más susceptibles a las aberraciones citoesqueléticas inducidas por INF2 que las neuronas9,19. En nuestra cohorte de estudio, los pacientes con fenotipo dual CMT/FSGS manifestaron las dos enfermedades casi simultáneamente y progresaron mucho más rápido a ESRD que aquellos con FSGS sola24. Estas observaciones clínicas sugieren que los pacientes con CMT/FSGS dual sufren un daño celular global más grave que, al igual que los pacientes con FSGS, probablemente surge de un mecanismo común que afecta principalmente a la organización del citoesqueleto. De acuerdo con esta posibilidad, los resultados de los estudios de expresión confirmaron que las células que expresan variantes de CMT/FSGS de hecho tenían un desarreglo citoesquelético y una perturbación de orgánulos más prominentes en comparación con las variantes de FSGS INF2, y el trastorno asociado con la variante CMT/FSGS excedería el umbral crítico para desencadenar la enfermedad. tanto en células de Schwann como en podocitos (Fig. 13). Sin embargo, se ha informado de una considerable diversidad fenotípica para las variantes INF2. Es necesario realizar más estudios con un estudio mutacional más amplio para comprender la correlación genotipo-fenotipo.

Modelo hipotético de mecanismos patogénicos subyacentes a un espectro de trastornos INF2. (A) Ubicaciones de mutaciones de INF2 y fenotipos clínicos. Dos fenotipos de la enfermedad INF2, CMT/FSGS dual o FSGS única, están relacionados con mutaciones de INF2, que se segregan con regiones distintivas del DID. Las variantes de CMT/FSGS se agrupan en los residuos 57 a 184 del DID, mientras que las variantes de FSGS se localizan principalmente en los residuos 184 a 245 del DID. Las células de Schwann degeneradas producen una fina vaina de mielina (neurona mielinizante) y/o protuberancias supernumerarias (neurona no mielinizante). Los podocitos degenerados se desprenden de la membrana basal. (B) Modelo propuesto para la patogénesis de la enfermedad. Las mutaciones de INF2 alteran principalmente la organización de la actina y los microtúbulos, lo que posteriormente conduce a una disfunción celular más global, incluida una morfología mitocondrial defectuosa y el tráfico de vesículas. Los efectos mutacionales se vuelven más graves con la edad, lo que refleja una acumulación gradual de daño sutil. Cuando el daño celular alcanza un umbral crítico, se produce la muerte celular y los fenotipos de la enfermedad comienzan a manifestarse clínicamente. Nuestro estudio de expresión muestra que las variantes de CMT/FSGS tienen efectos más nocivos que las variantes de FSGS en términos de desorganización del citoesqueleto y los orgánulos. Con base en (1) solo unas pocas mutaciones de INF2 que causan CMT sola y (2) el hecho de que la GEFS suele ser grave si coexisten fenotipos de CMT, es posible que los podocitos sean más susceptibles a la lesión inducida por la mutación de INF2 que las células de Schwann. , apoyando así la hipótesis de un umbral patógeno más bajo para la FSGS que para la CMT. Sin embargo, 3 de cada 30 casos notificados con variantes de CMT/FSGS mostraron un fenotipo de CMT predominante (CMT sola o con glomerulopatía mínima). Es obligatorio un estudio mutacional más amplio para verificar nuestra hipótesis de que el umbral patogénico de CMT (asteriscos) generalmente puede exceder el de FSGS. DID, dominio inhibidor diáfano; DAD, Dominio autorregulador diáfano; FSGS, glomeruloesclerosis focal y segmentaria; CMT, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth.

El modelado estructural reveló que las mutaciones de INF2 que causan CMT/FSGS estaban ubicadas exclusivamente en el bolsillo cóncavo del DID que forma la interfaz de unión de DAD y es fundamental para la autoinhibición5,8,9. Nuestros estudios estructurales respaldaron que las mutaciones INF2-DID podrían afectar las interacciones DID-DAD. En primer lugar, el modelado estructural de variantes patógenas de INF2 mostró cambios en los pares de aminoácidos y en el número de enlaces de hidrógeno, que son dos elementos clave para la interacción DID-DAD. Sin embargo, nuestra estimación de la energía libre no mostró diferencias observables entre las variantes CMT/FSGS y FSGS, de acuerdo con estudios previos19. En segundo lugar, nuestras simulaciones de dinámica molecular, asumiendo una solución acuosa, revelaron que todas las mutaciones patógenas de INF2 podrían alterar la flexibilidad y estabilidad del complejo DID-DAD. Descubrimos que las mutaciones afectan la estabilidad estructural general mediante el análisis RMSD y provocan cambios variables en la dinámica residual mediante el análisis RMSF. Para estimar con precisión el impacto de las mutaciones en la dinámica de las proteínas, realizamos el análisis MD durante un tiempo adecuado (500 ns). Estas simulaciones de MD son lo suficientemente largas para que la proteína explore el espacio conformacional y establezca el más estable. Esto permitió una estimación precisa de las interacciones de aminoácidos, por ejemplo, los cambios en la interacción de la cadena lateral a lo largo del tiempo (Figuras complementarias S6, 7, 8, 9).

El análisis MD reveló una variación en la flexibilidad de los residuos que interactúan entre las variantes patógenas. Nuestros análisis de RMSD y RMSF revelaron una tendencia de que las variantes de CMT/FSGS pueden causar cambios más pronunciados en la flexibilidad del complejo DID-DAD, en comparación con las otras variantes de INF2 (Figs. 4, 5 y 6, Figuras complementarias S6-S9). Sin embargo, no pudimos encontrar ninguna tendencia consistente de la DM que pudiera explicar la diferencia de gravedad fenotípica entre CMT/FSGS dual grave y la enfermedad FSGS única leve. Esto también se debe en parte a nuestro número limitado de variantes analizadas y a la variabilidad en los efectos estructurales de las mutaciones. Específicamente, algunas fluctuaciones de residuos locales pueden afectar directamente la conformación de las bolsas de unión, mientras que otras pueden influir secundariamente en el tamaño y la curvatura de la superficie de reconocimiento de DAD y sus vecinas. Por ejemplo, el aumento (desestabilizado) o la disminución (sobreestabilizado) en la flexibilidad del residuo del dominio DID podría obstaculizar estéricamente la interacción DID-DAD local, afectando así la afinidad de unión y/o la frecuencia de las interfaces DID-DAD25.

Encontramos un RMSF notablemente alto para los tres grupos principales en las regiones de unión a DAD del DID en INF2 de tipo salvaje en los residuos de 80–96, 152–164 y 180–194. Cada región corresponde a las estructuras de bucle flexible que conectan las hélices α en los bolsillos de unión DID, que se ensamblan con las hélices centrales (α7, α10 y α13) de la segunda, tercera y cuarta repeticiones de armadillo, respectivamente (Figura complementaria S3, S6)16,25. Esos loci fluctuantes están ubicados en las proximidades de los residuos que interactúan, 107–115, 146–152 y 203–206, de los cuales se predice que formarán el bolsillo que interactúa con DAD 16,25. Las estructuras superhelicoidales formadas por repeticiones de armadillo determinan la curvatura de la proteína adecuada para la unión del péptido. Numerosos estudios muestran que las repeticiones de armadillo formadas por hélices α DID permiten que estas proteínas tengan diversas interacciones y funciones en la célula y se conservan en todo el reino eucariota16,25. Nuestros resultados, junto con otros, indican que las mutaciones DID podrían alterar el patrón de interacción nativo de los residuos vecinos en las proximidades de las mutaciones, comprometiendo así la estabilidad de la proteína y la flexibilidad del complejo autoinhibitorio DID-DAD. Una simulación adicional de la DM, por ejemplo, la determinación de RMSF que incluya más variantes patógenas y la comparación con variantes benignas, ayudará a comprender qué residuos individuales podrían desempeñar un papel clave en las fluctuaciones estructurales del complejo proteico.

Intentamos determinar cómo las variantes de CMT/FSGS podrían ser más dañinas biológicamente que las variantes de FSGS. Los protocolos de transfección para las variantes de INF2 se optimizaron para minimizar la citotoxicidad mediante el seguimiento paralelo del fenotipo celular de los controles apropiados. Comparamos los efectos celulares de las variantes de INF2, en condiciones en las que las células transfectadas con un vector simulado o ADNc de INF2 de tipo salvaje (más las células no transfectadas circundantes) no mostraron ninguna alteración dañina en la organización de microtúbulos de actina y la interacción de orgánulos (Figura complementaria S10). ). Los efectos nocivos de las variantes de CMT/FSGS podrían deberse a su dosis reducida de INF2, como lo sugirieron los resultados de la transferencia Western que muestran que los niveles de proteína disminuyeron para las variantes de CMT/FSGS en relación con las de tipo salvaje. Una cantidad tan mínima de variantes de CMT/FSGS podría incluso desencadenar la enfermedad10.

Alternativamente, las variantes de CMT/FSGS que afectan los residuos 57 a 184 de DID podrían alterar las interacciones moleculares preexistentes o las vías específicas de los tejidos neuronales10. Por ejemplo, las variantes de CMT/FSGS pueden interferir preferentemente con la adaptación celular aguda en respuesta al estrés10. Estudios anteriores demostraron que INF2 participa en la remodelación de la arquitectura de actina durante la reparación del tejido después de una lesión10,11. Por lo tanto, las mutaciones de INF2 que causan CMT/FSGS pueden hacer que el tejido afectado sea más susceptible a sufrir lesiones debido a retrasos en los procesos de reparación necesarios para recuperarse de una lesión. Estudios anteriores revelaron que las variantes patógenas de INF2 alteraban los estallidos transitorios de actina inducidos por calcio en las células vivas y podían alterar los transcriptomas de larga data regulados por el factor de respuesta sérico que a su vez desregula otras funciones celulares más allá del citoesqueleto11,26. Se necesitan más estudios para definir el tejido. -mediadores específicos que actúan en podocitos y/o células de Schwann9.

Descubrimos que el grado de alteración de la red de microtúbulos es proporcional a la gravedad de la desorganización de la actina. Se sabe que INF2 colocaliza, se une directamente y media tanto en la agrupación como en la estabilización de los microtúbulos27,28,29. Por lo tanto, son posibles dos mecanismos para los efectos nocivos de las variantes de FSGS/CMT: las mutaciones de INF2 podrían desorganizar las redes de microtúbulos a través de efectos directos sobre los microtúbulos y/o tener consecuencias indirectas derivadas de interacciones alteradas entre actina y microtúbulos. Aquí encontramos que las células HeLa que expresan variantes patógenas de INF2 tendían a tener formas de células fusiformes con alargamiento bipolar (Fig. 7, 9), así como una disposición paralela inusual de microtúbulos. Estas características celulares recuerdan a las células que expresan variantes mDia1 constitutivamente activas, en las que las alteraciones en los microtúbulos impulsan principalmente el alargamiento celular. Por el contrario, estudios previos con células desactivadas de INF2 demostraron que INF2 desempeña un papel clave en la formación de lamellipodios de la corteza celular30. Dado que una variedad de interferencias de microtúbulos con estructuras basadas en actina en la corteza celular es esencial para estabilizar los microtúbulos27,29, especulamos que en las células que expresan variantes de INF2, los microtúbulos necesarios para capturar la actina cortical pueden ser defectuosos. Es probable que los mecanismos impliquen la protección de los microtúbulos del extremo positivo de crecimiento más rápido mediante la interacción con diferentes forminas y otras proteínas "estabilomas" que comprenden proteínas de seguimiento del extremo positivo y elementos de andamiaje (p. ej., IQGAP1) 19,27,28,29,30,31 .

Dado el gran exceso de monómeros de actina (~ 100 μM) frente a reguladores (0,05–4,21 μM), las células deben tener una estricta regulación espacio-temporal del ensamblaje de actina para mantener la polaridad y la forma celular, particularmente durante la proliferación y diferenciación activas32. Por este motivo, la activación de INF2 debe limitarse a regiones específicas, normalmente en la corteza celular6. Aquí demostramos que las células que expresan variantes patógenas de INF2 tenían niveles reducidos de fibras de estrés de actina y actina cortical, de acuerdo con informes anteriores8,9. En particular, la desorganización de la actina fue morfológicamente más pronunciada en las células que expresan variantes de CMT/FSGS que en las variantes de FSGS, lo que también concuerda con el estudio anterior10. El grado de perturbaciones citoesqueléticas causadas por las variantes patógenas de INF2 en nuestra inmunocitoquímica de células fijas se correlacionó con la gravedad de la reorganización defectuosa de actina inducida por Ca2+ (Ca-AR) informada en células HeLa vivas10,26. Sin embargo, no vimos cambios notables en los filopodios en nuestras células fijas que expresan variantes de INF2, lo que contrasta con observaciones anteriores que indican que las proteínas INF2 constitutivamente activas aumentan la longitud de los filopodios10,14. Nuestros datos, junto con los de otros investigadores, indican que las variantes de CMT/FSGS se asocian con una desorganización más pronunciada de las redes de actina que las variantes de FSGS. Las imágenes de células vivas ayudarán a aclarar cómo las mutaciones de INF2 afectan la dinámica de remodelación de la actina.

La disminución de los cables/haces de actina en las células HeLa que expresan variantes de INF2 es consistente con algunos estudios previos8,9, pero entra en conflicto con otros estudios que mostraron un aumento de los filamentos de actina en el RE y/o el citoplasma de las células U2OS derivadas del osteosarcoma12,17. El análisis histológico de los nervios surales biopsiados de pacientes con CMT/FSGS asociados con mutaciones INF2 reveló que las células no mielinizantes producen protuberancias supernumerarias similares a filopodios con acumulación anormal de actina en el citoplasma, lo que sugiere la presencia de actinopatía global. INF2 tiene una capacidad única para promover tanto la polimerización como la despolimerización de actina7,12,17,21,33 (Figura complementaria S17). Varios estudios in vitro con ensayos bioquímicos y transfección celular demostraron que las variantes patógenas de INF2 son funcionalmente constitutivamente activas7,10,12,14,17,31. Sin embargo, el efecto neto de esta activación constitutiva sobre el ensamblaje local de actina no está claro. Proponemos varias explicaciones para las diferencias entre nuestros resultados y resultados anteriores. En primer lugar, la regulación de la actividad de INF2 mediante autoinhibición in vivo puede diferir de la informada in vitro. Los estudios bioquímicos in vitro demostraron que, a diferencia de otras forminas, la unión de la actina G al dominio WH2-DAD alivia la autoinhibición de INF2 para activar la polimerización de actina17,21. Por el contrario, la actividad de autoinhibición de INF2 in vivo puede modificarse mediante concentraciones locales de monómero de actina celular29. En concentraciones más bajas de monómeros de actina que los niveles fisiológicos, las interacciones INF2 DID-DAD inhiben la polimerización, pero en concentraciones más altas no hay inhibición17,29. Las concentraciones de monómero de actina G dentro de la célula podrían cambiar dinámicamente (rango de 1 a 100 μM) en respuesta a cofactores (p. ej., proteínas secuestradoras de monómero de actina como profilina y timosina β4), proteínas de protección y actina-acetilación7,27,32. La alta afinidad de INF2 WH2-DAD por la actina G le permite servir como sensor de oscilaciones fisiológicas sutiles de los niveles de actina G citosólica y ajustar la polimerización de actina en respuesta al medio celular27. Además, los inhibidores celulares de INF2 como CAP1 y CAP27,17, así como la demanda local de adaptaciones morfológicas, también pueden modificar la nucleación y el alargamiento de la actina34.

En segundo lugar, la actividad de INF2 generaría filamentos de actina cortos y transitorios33. In vitro, INF2 despolimeriza bioquímicamente rápidamente los filamentos de actina, pero no está claro si se produce una actividad similar in vivo donde INF2 es abundante en relación con la actina12,17. La actividad de corte/despolimerización de INF2 podría activarse en respuesta al estallido de actina.

En tercer lugar, la desorganización de la actina causada por variantes de INF2 puede modificarse mediante interacciones heteroméricas aberrantes. Las variantes DID de INF2 afectan no solo el equilibrio de polimerización/despolimerización de actina,33 sino también la interferencia con los socios que interactúan, incluidos los miembros de la familia Rho de pequeñas GTPasas9,19 (Figura complementaria S18). Las interacciones entre formina también son importantes: mDia-DAD compite con los monómeros de actina por la unión de INF2-DID en trans11,29, regulando así negativamente la actividad de mDia. Por lo tanto, las variantes patógenas de INF2-DID podrían disminuir la regulación negativa normal por Rho-mDia y, a su vez, promover la polimerización de actina mediada por mDia11.

Las anomalías mitocondriales pueden tener impactos significativos en la variabilidad fenotípica, así como en la gravedad de los trastornos INF2. Aquí encontramos una fragmentación exagerada y una mala distribución periférica de las mitocondrias en células que expresan variantes de INF2. En particular, estos defectos mitocondriales fueron más pronunciados en las células que expresaban variantes de CMT/FSGS en comparación con aquellas que expresaban variantes de FSGS y la gravedad de los cambios mitocondriales se correlacionaba con el grado de desorganización citoesquelética. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que los defectos mitocondriales probablemente reflejen la red desregulada de microtúbulos de actina. En las células que expresan variantes de INF2, las mitocondrias tendían a desplazarse hacia la periferia celular y algunas mitocondrias se alineaban en paralelo con los microtúbulos desorganizados. La mala distribución mitocondrial inducida por las variantes de INF2 puede deberse a una disfunción de los microtúbulos. Los microtúbulos guían el transporte de las mitocondrias a áreas subcelulares específicas, como los procesos celulares de las neuronas y los podocitos35. Además, las redes de microtúbulos tienen una función global que posiciona el complejo de Golgi cerca del centrosoma y extiende el RE hasta el borde de las células36. La fusión-fisión defectuosa de las mitocondrias en los sitios de contacto entre el RE y las mitocondrias también puede afectar el tráfico y la fijación de las mitocondrias.

Alternativamente, los cambios en la distribución de las mitocondrias pueden estar asociados con una propiedad intrínseca de las variantes de INF2 que perturba sus interacciones en el RE y las mitocondrias. De acuerdo con los resultados de nuestro estudio de expresión, la expresión de la variante INF2-A149D constitutivamente activa en células HeLa aumenta la fisión de las mitocondrias al tiempo que reduce la movilidad celular y los eventos de fusión, como se observó en un estudio anterior que utilizó células U2OS12,17. Las mitocondrias sufren continuas fusiones y fisiones, cuyo equilibrio determina su morfología. INF2 desempeña un papel de apoyo en la fisión de las mitocondrias, posiblemente impulsando la constricción inicial de las mitocondrias, lo que facilita la constricción secundaria impulsada por Drp1 12. La regulación de la dinámica de las mitocondrias también cumple diversas funciones celulares, incluida la motilidad y el tráfico mitocondrial, así como las interacciones con otros orgánulos como el RE37,38. Hasta el 20% de la superficie mitocondrial está en estrecha aposición con las membranas del RE. Esta interfaz funciona como un centro crucial para la señalización del calcio, la apoptosis, la autofagia y la biosíntesis de lípidos y, por lo tanto, está estrechamente asociada con la vida y muerte celular 37.

Los podocitos y los nervios periféricos tienen una mayor demanda de energía en relación con otros tipos de células y, por lo tanto, deben mantener la dinámica y distribución de las mitocondrias a lo largo de sus procesos largos y/o múltiples altamente especializados. Es importante destacar que las mutaciones en genes que participan en la fisión mitocondrial (p. ej., MFN2, OPA1 y GDAP1) son una causa importante de CMT39,40 (Tabla complementaria S7). De manera similar a INF2, MFN2, que codifica una proteína de la membrana externa de las mitocondrias enriquecida en los sitios de contacto entre el RE y las mitocondrias, causa una neuropatía axonal (CMT2A2) asociada con la interrupción de las interacciones entre el RE y las mitocondrias y el tráfico mitocondrial39,41. La evaluación histológica previa de los nervios surales biopsiados en pacientes con CMT/FSGS inducida por mutaciones de INF2 no mostró anomalías mitocondriales, a diferencia de las de CMT derivadas de mutaciones de MFN242. Una fracción significativa de los genes axonales de CMT está relacionada con la movilidad mitocondrial, lo que sugiere que el defecto del tráfico de orgánulos es un mecanismo central para CMT38 (tabla complementaria S7).

Nuestro estudio con células que expresan variantes de INF2 sugiere que las anomalías mitocondriales pueden ser una consecuencia crítica de la desorganización de la red de actina y microtúbulos. Estos cambios juntos pueden afectar la viabilidad tanto de los podocitos como de las neuronas periféricas (Figura complementaria S19). Estudios adicionales para determinar los mecanismos específicos de tejido que subyacen a los trastornos INF2 podrían conducir a intervenciones terapéuticas más racionales para CMT/FSGS y allanar el camino para el desarrollo de medicamentos dirigidos y personalizados.

Todos los procedimientos estuvieron de acuerdo con los estándares éticos del comité de estudios en humanos (institucionales y nacionales) y con la Declaración de Helsinki. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos y/o de sus tutores legales. Inscribimos a 20 familias japonesas y 50 casos esporádicos con FSGS43. La GEFS se definió por la presencia de esclerosis segmentaria en algunos glomérulos, y las familias se determinaron basándose en al menos un individuo con GEFS comprobada por biopsia y al menos un pariente sanguíneo adicional afectado por proteinuria (definida como proteinuria igual o superior a ++ o una relación albúmina/creatinina en orina superior a 300 mg/gCr), insuficiencia renal progresiva o enfermedad renal comprobada por biopsia1,2,3,4,5. Excluimos todos los casos de GEFS secundaria debido a enfermedades sistémicas (obesidad, hipertensión, infección por VIH, etc.) u otras enfermedades renales hereditarias (síndrome de Alport, enfermedad de la membrana basal delgada, enfermedad de Fabry, etc.).

El ADN genómico se aisló de las células de sangre periférica utilizando el kit de aislamiento de sangre QIAamp DNA (Qiagen). Investigamos en una cohorte de 50 familias con SRNS con o sin neuropatía periférica43. Los pacientes índice fueron evaluados mediante panel objetivo o secuenciación del exoma completo. La cosegregación de variantes se confirmó mediante secuenciación para miembros de la familia. Se examinaron todas las variantes de codificación raras y no sinónimas. Las variantes raras se definieron por la frecuencia del alelo menor inferior al 1% en las bases de datos públicas. Con respecto a la patogenicidad de la variante, varios algoritmos, incluidos PolyPhen2, SIFT, M-CAP, LRT y Mutation Taster, predijeron efectos dañinos. Se aplicó un enfoque sistemático y escalonado para el análisis y la interpretación de los datos de secuencia. Las variantes denominadas fueron interpretadas y clasificadas según las recomendaciones del Colegio Americano de Genética y Genómica Médica (ACMG). Se analizaron más a fondo las variantes clasificadas como patógenas o probablemente patógenas (categoría 1 o 2 según ACMG).

Se utilizaron las construcciones de ADNc, en las que el INF2 humano de longitud completa (NM_022489, la isoforma CAAX prenilada) se subclonó en los vectores pcDNA 3.1 con etiquetas cMyc o GFP. Para la inmunocitoquímica y el análisis Western, se utilizó INF2 marcado con cMyc N-terminal (GeneCopoeia Ex-Z4823-M43) como tipo salvaje. Las sustituciones de base única de las variantes de INF2 G73D, V108D, T161N, R218W y N202S se introdujeron mediante síntesis de ADN artificial para fragmentos flanqueados por sitios SalI o Hind III (Genescript). Las reacciones de mutagénesis se verificaron para ambas cadenas mediante secuenciación de Sanger. Para obtener imágenes de células vivas, se utilizó el clon ORF de pcDNA3.1 + N-eGFP (Genescript ID: OHu18878C) como tipo salvaje. Se introdujeron sustituciones de nucleótido único p.G73D y una sustitución de p.T161N mediante síntesis de ADN artificial de sitios KpnI/XhoI y sitios enzimáticos, respectivamente. Se utilizó un vector que contenía oligonucleótidos codificados (OmicsLink Expression Clone: ​​EX-NEG-M43) como control de transfección.

Todas las variantes que identificamos se encuentran dentro del DID, que comprende un dominio autoinhibidor en la forma diáfana. En este contexto, utilizamos las estructuras del complejo mDia1 DID/DAD autoinhibido (PDB:2F31), en el que el DID N-terminal interactúa con el DAD C-terminal, sirviendo así a la autoinhibición de las funciones de mDia16. La estructura tridimensional del INF2 humano se modeló basándose en la estructura cristalina del mDia PDB 2F31 de ratón. El modelado se realizó mediante el método de modelado comparativo utilizando el programa Rosetta en la plataforma Robetta (http://new.robetta.org). Para evaluar los posibles efectos estructurales de las mutaciones de INF2, modelamos las variantes de INF2 basándose en un modelo de tipo salvaje utilizando la función myPresto con 10.000 rondas de minimización. El área de interfaz (Å) y la energía libre (ΔG) de las variantes patógenas de INF2 se predijeron utilizando el software PISA (//www.ebi.ac.uk/pdbe/pisa/)44. Los diagramas de interacción proteína-proteína fueron predichos por el programa PDBsum45. Para comparar nuestra estructura modelada y la de AlphaFold, el modelo de INF2 humano se recuperó de la base de datos de estructura de proteínas AlphaFold (//alphafold.ebi.ac.uk).

Las simulaciones MD del INF2 de tipo salvaje y sus variantes se realizaron en condiciones límite periódicas utilizando GROMACS 2022.5, el campo de fuerza Amber ff99SB para proteínas e iones y el modelo TIP3P para moléculas de agua 46,47. Se colocaron moléculas de agua alrededor del modelo de proteína en una caja de 2 nm que contenía aproximadamente 26.000 moléculas de agua. Los iones se colocaron a 150 mM, igual que in vivo, y se utilizó SLTCAP para calcular el número de iones48,49.

Las interacciones electrostáticas se calcularon utilizando el método de malla de partículas de Ewald (PME) con un radio de corte de 1,0 nm. Las interacciones de Van der Waals también se cortaron a 1,0 nm. Se utilizó el algoritmo LINKS para la fijación de la longitud de la unión. Se utilizó el método Steepest Descent para minimizar la energía, el método V-rescale se utilizó para controlar la temperatura de equilibrio a 310 K y el método Parrinello-Rahman se utilizó para mantener la presión a 105 Pa. Primero, se midió la energía del sistema. se minimizó a 1000,0 kJ/mol/nm mediante minimización de energía, seguido de 200 ps de equilibrio NVT y 800 ps de equilibrio NPT, y luego se realizó una ejecución de producción de 500 ns. La salida de la trayectoria se extrajo cada 1 ns, donde se estableció el paso de tiempo de 2 fs para todas las simulaciones (500.000 pasos). Comparamos la dinámica molecular entre INF2 de tipo salvaje y variantes patógenas capturando y alineando las imágenes con el software VMD (//www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/). Seguimiento de los cambios dinámicos en las posiciones de los residuos en la interfaz DID y DAD durante 500 ns (250.000.000 de pasos). Para el análisis RMSF, se utilizaron los resultados después de 100 ns, cuando el RMSD del cálculo MD se estabilizó50.

Se cultivaron células HeLa (RCB0007, RIKEN BRC) o COS-7 (RCB0539) en medio DMEM (Wako, 043-30085) con suero bovino fetal al 10%. Las células se mantuvieron en condiciones normales de cultivo con 5% de CO2 y 37 °C de temperatura y el medio se cambió cada 48 h hasta alcanzar un 80% de confluencia. En este punto, las células se lavaron suavemente con PBS (-) y tripsinización utilizando 1 ml de TrypLE Express (Gibco, 12605-101).

Las células cultivadas en cubreobjetos (1 x 105 células en una placa de 12 pocillos) se transfectaron con 1 μg de construcciones de plásmidos, ya sea INF2 de tipo salvaje o variantes patógenas, mediante el uso de TransIT-LT1 (Mirus, MIR 2300). Después de 8 h de transfección, las células se fijaron en PFA al 4% en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de enjuagar en PBS, las células se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% durante 10 minutos, seguido del bloqueo en suero de cabra al 5% (Wako, 143-06561) durante 1 hora a temperatura ambiente. El INF2 marcado con cMyc se visualizó mediante un anticuerpo monoclonal primario anti-cMyc (1:1000, Sigma, #4439) y un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia (1:1000, anti-ratón Alexa 488) durante 60 minutos a temperatura ambiente. Para la detección de filamentos de actina, se añadió fluorescente 633 conjugado con faloidina (1:50, Thermofisher, A22284) a la solución de anticuerpo secundario. Los núcleos se tiñeron con DAPI y los cubreobjetos se montaron con el reactivo antifade Prolong Gold (Invitrogen, P36930). Las imágenes de inmunofluorescencia se obtuvieron con el microscopio confocal Olympus FV3000 y se centraron en los filamentos de actina en el área periférica. Las fotografías se capturaron utilizando un Plan Apo Oil 63X/1.4 combinado con un píxeles de gran formato de 1024 × 1024.

El patrón de tinción de las fibras de estrés por faloidina se clasificó en cuatro subgrupos según las características morfológicas: tipos A (> 90% del área celular llena de cables gruesos), tipo B (al menos 2 cables gruesos que corren debajo del núcleo y el resto del área celular). llenos de cables finos) patrones de tinción, tipo C (sin cables gruesos, pero algunos cables presentes) y tipo D (sin cables visibles en el área central de la celda)22,23. Las imágenes fueron analizadas mediante inspección visual o clasificación automatizada mediante aprendizaje automático.

Se contaron aproximadamente 500 células por construcción de transfección en 3 a 6 experimentos independientes.

Para el etiquetado mitocondrial en imágenes en vivo, las células se sembraron en una placa con fondo de vidrio (35 mm) con una densidad celular de 3 × 105 células durante 24 h para alcanzar una confluencia del 80% y el medio se cambió antes de la transfección. Las células se transfectaron con 2,5 μg de plásmidos INF2 etiquetados con GFP en las células utilizando Lipofectamine P3000 y se incubaron a 37 ° C durante 8 h. Después de eso, las células se marcaron con MitoTracker Red CMXRos (Thermofisher, M7512) a una concentración de 100 nM durante 15 minutos a temperatura ambiente en DMEM sin rojo de fenol. Las imágenes de células vivas se realizaron mediante microscopía confocal Zeiss LSM700. Para visualizar la dinámica de las mitocondrias, se obtuvieron imágenes de lapso de tiempo con cada intervalo de 5 s durante 10 min.

Para clasificar el patrón de las mitocondrias, las células se fijaron con paraformaldehído al 4%. Los patrones morfológicos se cuantificaron clasificando la apariencia de las mitocondrias en tres subclases (tubulares, mixtas y fragmentadas) en células transfectadas según el protocolo descrito previamente51,52. Para analizar la motilidad de las mitocondrias 2D, tomamos una pila representativa de la célula (20 células/cada tipo) y medimos la longitud mitocondrial, proyecciones de intensidad máxima de la serie z con incrementos de 0,5 μm para el canal rojo (MitoTracker)12. Se seleccionaron las regiones planas de las células con mitocondrias claramente resueltas y se midieron 10 mitocondrias por célula utilizando la herramienta de líneas en el software de imágenes NIH. Para el perfil de intensidad, ImageJ trazó los perfiles de intensidad de las señales mitocondriales a lo largo de las líneas. Las imágenes se convirtieron digitalmente a escala de grises de 8 bits y se analizaron mediante el comando de trazado de superficie. Se reconstituyó un gráfico 3D como eje Y que representa la intensidad (valor gris) de las mitocondrias, mientras que el eje X y el eje Z demostraron la forma y el tamaño de las células, respectivamente.

Inicializamos nuestros parámetros de red con el conjunto de parámetros predeterminado proporcionado para CNN profunda, ALEXNET, y luego ajustamos los parámetros de la última capa de las redes en nuestros datos mediante retropropagación utilizando dos unidades de procesamiento gráfico NVIDIA GeForce RTX 2080Ti. La función de pérdida se definió como la entropía cruzada entre la probabilidad predicha y las etiquetas de clase verdaderas, y utilizamos la optimización SGDM con una tasa de aprendizaje de 0,0001 y un impulso de 0,9 para entrenar los pesos.

Para la clasificación de la morfología de las mitocondrias, obtuvimos 1024 × 1024 píxeles de 34 imágenes para INF2 de tipo salvaje y la variante p.T161N, respectivamente. Después de recortar las imágenes de células HeLa transfectadas de acuerdo con las señales de GFP, extrajimos aleatoriamente 227 × 227 píxeles de 6800 (100 × 34 × 2) imágenes de las imágenes originales como entrada de ALEXNET y utilizamos el 7% (400/6800) de ellas para capacitación.

Para la clasificación de la morfología de la actina, obtuvimos 56 imágenes de células de tipo salvaje y 79 de expresión mutante y utilizamos el 3% (400) de los 227 × 227 píxeles extraídos de 13,500 (100 × (56 + 79)) imágenes para el entrenamiento. Las diferencias estadísticas en las puntuaciones de morfología entre las variantes de tipo salvaje y p.T161N se evaluaron con la prueba de suma de rangos de Wilcoxon.

Para teñir los microtúbulos, las células se marcaron primero con anticuerpo antitubulina (1:300, Abcam, ab7291) y luego se incubaron con el anticuerpo secundario marcado con fluorescencia (1:1000, Abcam, ab150115). Mediante inspección visual de tinción por inmunofluorescencia de β-tubulina, los patrones subcelulares se clasificaron en 3 subgrupos mediante el uso de los siguientes criterios: (i) orientados en una matriz radiante extendida desde el área del centrosoma cerca de los núcleos (el centro organizador de microtúbulos) hasta la periferia (subtipo normal), (ii) configuración mixta intermedia y heterogénea que consiste en haces gruesos e irradiados normales desorganizados en paralelo (subtipo intermedio), y (iii) más alineados a lo largo del eje longitudinal de las células (subtipo desorganizado)53. Todas las imágenes fueron calificadas por al menos tres evaluadores independientes.

Los datos se expresaron como media ± SEM. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student de dos colas o ANOVA unidireccional (SigmaStat, versión 3.1.1). El análisis de supervivencia se llevó a cabo mediante la prueba de rangos logarítmicos (Prism 8; GraphPad). Las diferencias por pares en una distribución proporcional de cuatro categorías fenotípicas de actina entre INF2 de tipo salvaje y variantes se analizaron mediante el uso de la prueba exacta de Fisher en el programa R con múltiples correcciones de prueba. P <0,05 se consideró significativo.

Las células se homogeneizaron mediante un homogeneizador Dounce en tampón RIPA (Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, SDS al 0,1%, desoxicolato de Na al 0,5%, Triton X-100 al 1% e inhibidores de proteasa) suplementado con tabletas inhibidoras de proteasa SIGMAFAST (Millipore- Sigma). Los lisados ​​se limpiaron mediante centrifugación a 13.000 g, durante 20 min. Después de calentar a 95 °C durante 5 minutos en tampón de muestra Laemmli que contenía β-mercaptoetanol, se cargaron aproximadamente 25 µg de muestras por pocillo y se separaron mediante geles de SDS-PAGE al 7,5 %. Luego, las proteínas se transfirieron a las membranas de membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) mediante Mini Trans-Blot Cell (Bio-Rad) (30 V, 6 h). La membrana se bloqueó con BSA al 5% durante 1 h, luego se incubó con anticuerpos primarios (anti-cMyc 9106, 1:100 o anti-β tubulina, 1:300) a 4 °C durante la noche. Después de lavar con PBS-T, la membrana se incubó con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) (1:5000) (NA931, Amersham) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las señales se detectaron mediante quimioluminiscencia y se capturaron utilizando un sistema de imágenes (LAS-4000, Fujifilm).

El paciente (II-1) notó por primera vez proteinuria a los 11 años en un chequeo regular y presentó SRNS a los 11 años54. La biopsia renal reveló GEFS con lesiones túbulo-intersticiales. A pesar de la terapia inmunosupresora, finalmente progresó a ESRD a los 14 años. Notó por primera vez dificultades para caminar a los 14 años. La evaluación neurológica a los 15 años reveló que tenía marcha en estepaje con deformidad del pie cavo y debilidad de los músculos distales. Se observó atrofia muscular en las extremidades superiores e inferiores, y los reflejos tendinosos profundos disminuyeron en las extremidades inferiores. No se observó ninguna alteración sensorial.

Paciente (II-3), hermano menor del caso II-1. No se observó consanguinidad de los padres. Manifestó proteinuria por primera vez a los 6 años. La proteinuria aumentó gradualmente hasta un nivel nefrótico a los 11 años. Se le realizó una biopsia renal a los 11 años con un diagnóstico de GEFS y finalmente progresó a ESRD a los 15 años. La evaluación neurológica a los 12 años demostró debilidad muscular distal con marcha en estepa y atrofia muscular en las extremidades superiores e inferiores. Los reflejos tendinosos profundos estaban disminuidos en las extremidades inferiores. No hubo alteraciones sensoriales en las neuronas periféricas.

El paciente (II-1) notó por primera vez proteinuria a los 11 años y desarrolló síndrome nefrótico a los 1455 años. La biopsia renal a los 14 años reveló GEFS. La enfermedad renal era resistente a la terapia con esteroides y progresó a ESRD a los 16 años. Tenía dificultades para caminar desde la infancia. La deformidad del pie cavo se corrigió mediante cirugía ortopédica a los 11 años. El examen neurológico a los 14 años demostró la marcha en estepaje con atrofia asimétrica y debilidad en los músculos peroneos y tibiales. Un audiograma reveló una sordera neurosensorial bilateral con una pérdida auditiva de 50 dB. Varias pruebas auditivas sugirieron que la incapacidad auditiva se atribuye a la periferia auditiva, la cóclea o los nervios auditivos.

El paciente (II-1) manifestó por primera vez proteinuria en un control regular a los 11 años. Desarrolló proteinuria nefrótica a los 13 años con deterioro de las funciones renales. La biopsia renal a los 14 años reveló GEFS en ausencia de depósitos inmunes. Había sido tratado con esteroides e inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina y bloqueadores de los receptores de angiotensina en combinación. La enfermedad renal era resistente a los esteroides con deterioro funcional progresivo y eventualmente alcanzó ESRD a los 14 años. Notó dificultad para caminar a los 15 años. En el examen neurológico a los 15 años, exhibió debilidad y atrofia muscular predominantemente en las extremidades inferiores y tenía escalonamiento. marcha con pie caído y deformidad del pie cavo. Se informaron variantes de INF2 en un estudio mutacional de SRNS56.

El paciente (II-1) presentó por primera vez proteinuria en control periódico a los 1.454 años. La primera biopsia renal fue diagnosticada de SCMN. Debido al deterioro de la función renal y al aumento de la proteinuria, se le realizó una segunda biopsia renal a los 16 años, que reveló una histología de GEFS. La enfermedad renal era resistente a la terapia con esteroides y progresó a ESRD a los 17 años. Notó por primera vez dificultad para caminar a los 10 años y le diagnosticaron CMT. En el examen neurológico a los 17 años, se observó atrofia muscular en los músculos distales del antebrazo y las extremidades inferiores con ausencia de reflejos tendinosos profundos distales. Tenía una alteración progresiva de la marcha con marcha en estepa. No se observaron discapacidades intelectuales ni auditivas. La biopsia del nervio peroneo reveló degeneración en fibras mielinizadas grandes con formación de bulbo de cebolla, que se observa típicamente en el subtipo desmielinizante CMT1.

La investigación relacionada con sujetos humanos ha cumplido con todas las regulaciones nacionales relevantes, políticas institucionales y de acuerdo con la Declaración de Helsinki, y ha sido aprobada por la junta de revisión institucional de la Universidad Médica de Kansai (2008902) y cada afiliación.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles en el repositorio de revisión temporal [Plantilla de envío de Ueda & Quynh], en https://drive.google.com/drive/folders/1lvFWS6hiOVqPHuv-y8Sat-FiIMXSy3X_?usp=sharing .

D'Agati, VD, Kaskel, FJ y Falk, RJ Glomeruloesclerosis segmentaria focal. N. inglés. J. Med. 365, 2398–2411. https://doi.org/10.1056/NEJMra1106556 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Sadowski, CE y cols. Una causa monogénica en el 29,5% de los casos de síndrome nefrótico resistente a esteroides. Mermelada. Soc. Nefrol. 26 DE JANE, 1279–1289. https://doi.org/10.1681/asn.2014050489 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Perico, L., Conti, S., Benigni, A. y Remuzzi, G. Dinámica de podocitos-actina en la salud y la enfermedad. Nat. Rev. Nephrol. 12, 692–710. https://doi.org/10.1038/nrneph.2016.127 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Barua, M. et al. Las mutaciones en el gen INF2 representan una proporción significativa de la glomeruloesclerosis focal y segmentaria familiar, pero no esporádica. Riñón Int. 83, 316–322. https://doi.org/10.1038/ki.2012.349 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Boyer, O. y col. Las mutaciones en INF2 son una causa importante de glomeruloesclerosis focal y segmentaria autosómica dominante. Mermelada. Soc. Nefrol. 22, 239–245. https://doi.org/10.1681/asn.2010050518 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chesarone, MA, DuPage, AG y Goode, BL Liberación de forminas para remodelar los citoesqueletos de actina y microtúbulos. Nat. Rev. Mol. Biol celular. 11, 62–74. https://doi.org/10.1038/nrm2816 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Mu, A., Fung, TS, Kettenbach, AN, Chakrabarti, R. & Higgs, HN Un complejo que contiene lisina-actina acetilada inhibe la formina INF2. Nat. Biol celular. 21, 592–602. https://doi.org/10.1038/s41556-019-0307-4 (2019).

Artículo CAS PubMed Central Google Scholar

Brown, EJ y cols. Las mutaciones en el gen INF2 de la formina causan glomeruloesclerosis focal y segmentaria. Nat. Gineta. 42, 72–76. https://doi.org/10.1038/ng.505 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Boyer, O. y col. Mutaciones INF2 en la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth con glomerulopatía. N. inglés. J. Med. 365, 2377–2388. https://doi.org/10.1056/NEJMoa1109122 (2011).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Bayraktar, S. y col. Una respuesta desregulada al estrés subyace a distintos perfiles de enfermedades asociadas a INF2. Mermelada. Soc. Nefrol. 31, 1296-1313. https://doi.org/10.1681/asn.2019111174 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sun, H., Schlondorff, JS, Brown, EJ, Higgs, HN y Pollak, MR La activación Rho de las forminas mDia está modulada por una interacción con la formina 2 invertida (INF2). Proc. Nacional. Acad. Ciencia. Estados Unidos 108, 2933–2938. https://doi.org/10.1073/pnas.1017010108 (2011).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Korobova, F., Ramabhadran, V. & Higgs, HN Un paso dependiente de actina en la fisión mitocondrial mediada por la formina INF2 asociada al RE. Ciencia 339, 464–467. https://doi.org/10.1126/science.1228360 (2013).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Sun, H., Perez-Gill, C., Schlöndorff, JS, Subramanian, B. y Pollak, MR El tráfico desregulado de nefrina mediado por dineína causa podocitopatía relacionada con INF2. Mermelada. Soc. Nefrol. 32, 307–322. https://doi.org/10.1681/asn.2020081109 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Madrid, R. et al. La formina INF2 regula la transcitosis basolateral a apical y la formación de luz en asociación con Cdc42 y MAL2. Desarrollo. Celda 18, 814–827. https://doi.org/10.1016/j.devcel.2010.04.001 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Pareyson, D., Scaioli, V. & Laurà, M. Aspectos clínicos y electrofisiológicos de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth. Neuromol. Medicina. 8, 3–22. https://doi.org/10.1385/nmm:8:1-2:3 (2006).

Artículo CAS Google Scholar

Nezami, AG, Poy, F. & Eck, MJ Estructura del interruptor autoinhibitorio en la forma mDia1. Estructura (Londres, Inglaterra: 1993) 14, 257–263. https://doi.org/10.1016/j.str.2005.12.003 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ramabhadran, V., Hatch, AL & Higgs, HN Los monómeros de actina activan la forma 2 invertida compitiendo con su interacción autoinhibitoria. J. Biol. Química. 288, 26847–26855. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.472415 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Saltador, J. et al. Predicción de estructura de proteínas de alta precisión con AlphaFold. Naturaleza 596, 583–589. https://doi.org/10.1038/s41586-021-03819-2 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Labat-de-Hoz, L. & Alonso, MA La forma INF2 en la enfermedad: avances de 10 años de investigación. Celúla. Mol. Ciencias de la vida. CMLS 77, 4581–4600. https://doi.org/10.1007/s00018-020-03550-7 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ishizaki, T. y col. Coordinación de los microtúbulos y el citoesqueleto de actina por el efector Rho mDia1. Nat. Biol celular. 3, 8–14. https://doi.org/10.1038/35050598 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Chhabra, ES, Ramabhadran, V., Gerber, SA & Higgs, HN INF2 es una proteína formina asociada al retículo endoplásmico. J. Ciencia celular. 122, 1430-1440. https://doi.org/10.1242/jcs.040691 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Verderame, M., Alcorta, D., Egnor, M., Smith, K. y Pollack, R. Patrones de actina F citoesquelética cuantificados con isotiocianato de fluoresceína-faloidina en células normales y transformadas. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. Estados Unidos 77, 6624–6628. https://doi.org/10.1073/pnas.77.11.6624 (1980).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tian, ​​X. y col. La talina1 asociada a podocitos es fundamental para el mantenimiento de la barrera de filtración glomerular. J.Clin. Invertir. 124, 1098-1113. https://doi.org/10.1172/jci69778 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mademan, I. et al. Las mutaciones de novo INF2 amplían el espectro genético de la neuropatía hereditaria con glomerulopatía. Neurología 81, 1953–1958. https://doi.org/10.1212/01.wnl.0000436615.58705.c9 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Rosa, R. y col. Conocimientos estructurales y mecanicistas sobre la interacción entre Rho y los mamíferos Dia. Naturaleza 435, 513–518. https://doi.org/10.1038/nature03604 (2005).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Gales, P. et al. El restablecimiento de actina mediado por calcio (CaAR) media adaptaciones celulares agudas. Elife https://doi.org/10.7554/eLife.19850 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Fernández-Barrera, J. & Alonso, MA Coordinación de la acetilación de microtúbulos y del citoesqueleto de actina por forminas. Celúla. Mol. Ciencias de la vida. CMLS 75, 3181–3191. https://doi.org/10.1007/s00018-018-2855-3 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Bartolini, F. y col. Una cascada de activación de formina mDia1-INF2 facilitada por IQGAP1 regula los microtúbulos estables en las células migratorias. Mol. Biol. Celda 27, 1797–1808. https://doi.org/10.1091/mbc.E15-07-0489 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hegsted, A., Yingling, CV y ​​Pruyne, D. Formas invertidas: una subfamilia de formas atípicas. Citoesqueleto 74, 405–419. https://doi.org/10.1002/cm.21409 (2017).

Artículo PubMed Google Scholar

Sun, H., Schlondorff, J., Higgs, HN y Pollak, MR La formina 2 invertida regula la dinámica de la actina al antagonizar la señalización de la formina relacionada con Rho/diáfana. Mermelada. Soc. Nefrol. 24, 917–929. https://doi.org/10.1681/asn.2012080834 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shaye, DD y Greenwald, I. La formina INF2/EXC-6 asociada a la enfermedad organiza la luz y el crecimiento celular durante la tubulogénesis mediante la regulación de la actina F y los citoesqueletos de microtúbulos. Desarrollo. Celda 32, 743–755. https://doi.org/10.1016/j.devcel.2015.01.009 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Mu, A. y col. Regulación de la polimerización de actina mediada por INF2 mediante la acetilación de lisina específica del sitio de la propia actina. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. Estados Unidos soy. 117, 439–447. https://doi.org/10.1073/pnas.1914072117 (2020).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Chhabra, ES & Higgs, HN INF2 es una formina que contiene un motivo de homología WASP 2 que corta los filamentos de actina y acelera tanto la polimerización como la despolimerización. J. Biol. Química. 281, 26754–26767. https://doi.org/10.1074/jbc.M604666200 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Gaillard, J. y col. Interacciones diferenciales de las formas INF2, mDia1 y mDia2 con los microtúbulos. Mol. Biol. Celda 22, 4575–4587. https://doi.org/10.1091/mbc.E11-07-0616 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, H. & Chan, DC Dinámica mitocondrial (fusión, fisión, movimiento y mitofagia) en enfermedades neurodegenerativas. Tararear. Mol. Gineta. 18, R169-176. https://doi.org/10.1093/hmg/ddp326 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Koppers, M., Özkan, N. & Farías, GG interacciones complejas entre orgánulos unidos a membranas, condensados ​​biomoleculares y el citoesqueleto. Frente. Desarrollo celular. Biol. 8, 618733. https://doi.org/10.3389/fcell.2020.618733 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Naon, D. & Scorrano, L. A la distancia correcta: yuxtaposición ER-mitocondrias en la vida y muerte celular. Biochim. Biofísica. Actas 1843, 2184–2194. https://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2014.05.011 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Schiavon, CR, Shadel, GS y Manor, U. Deterioro de la movilidad mitocondrial en la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth. Frente. Desarrollo celular. Biol. 9, 624823. https://doi.org/10.3389/fcell.2021.624823 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Palau, F., Estela, A., Pla-Martín, D. & Sánchez-Piris, M. El papel de la dinámica de la red mitocondrial en la patogénesis de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth. Adv. Exp. Medicina. Biol. 652, 129-137. https://doi.org/10.1007/978-90-481-2813-6_9 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Chan, DC Fusión y fisión: procesos interconectados críticos para la salud mitocondrial. Año. Rev. Genet. 46, 265–287. https://doi.org/10.1146/annurev-genet-110410-132529 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

de Brito, OM & Scorrano, L. Un enlace íntimo: organización espacial de la relación retículo endoplásmico-mitocondrias. Embo J. 29, 2715–2723. https://doi.org/10.1038/emboj.2010.177 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mathis, S. y col. Caracterización neuropatológica de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth relacionada con INF2: evidencia de una actinopatía de células de Schwann. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 73, 223–233. https://doi.org/10.1097/nen.0000000000000047 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Miyake, N. y col. Las mutaciones bialélicas en la subunidad NUP107 del complejo de poros nucleares causan el síndrome nefrótico resistente a los esteroides de aparición temprana en la infancia. Soy. J. Hum. Gineta. 97, 555–566. https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2015.08.013 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Krissinel, E. y Henrick, K. Inferencia de conjuntos macromoleculares a partir del estado cristalino. J. Mol. Biol. 372, 774–797. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2007.05.022 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Laskowski, RA, Jabłońska, J., Pravda, L., Vařekova, RS & Thornton, JM PDBsum: Resúmenes estructurales de las entradas del PDB. Ciencia de las proteínas. Publ. Sociedad de proteínas. 27, 129-1 https://doi.org/10.1002/pro.3289 (2018).

Artículo CAS Google Scholar

Los equipos de desarrollo de GROMACS en el Real Instituto de Tecnología y la Universidad de Uppsala, Suecia. GROMACS. http://www.gromacs.org/ (2022)

Pronk, S. y col. GROMACS 4.5: un conjunto de herramientas de simulación molecular de código abierto, altamente paralelo y de alto rendimiento. Bioinformática 29, 845–854. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btt055 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schmit, JD, Kariyawasam, NL, Needham, V. & Smith, PE SLTCAP: un método simple para calcular la cantidad de iones necesarios para la simulación MD. J. química. Computación teórica. 14, 1823–1827. https://doi.org/10.1021/acs.jctc.7b01254 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Machado, MR & Pantano, S. ¡Dividimos la diferencia de carga en dos! Una regla general para agregar cantidades adecuadas de iones en simulaciones de MD. J. química. Computación teórica. 16, 1367-1372. https://doi.org/10.1021/acs.jctc.9b00953 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Benson, NC y Daggett, V. Una comparación de métodos multiescala para el análisis de simulaciones de dinámica molecular. J. Física. Química. B 116, 8722–8731. https://doi.org/10.1021/jp302103t (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Niemann, A., Wagner, KM, Ruegg, M. & Suter, U. Las mutaciones de GDAP1 difieren en sus efectos sobre la dinámica mitocondrial y la apoptosis según el modo de herencia. Neurobiol. Dis. 36, 509–520. https://doi.org/10.1016/j.nbd.2009.09.011 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Salabei, JK & Hill, BG La fisión mitocondrial inducida por el factor de crecimiento derivado de plaquetas regula la bioenergética de las células del músculo liso vascular y la proliferación celular. Biol Redox. 1, 542–551. https://doi.org/10.1016/j.redox.2013.10.011 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Züchner, S. et al. Las mutaciones en el dominio de homología de pleckstrina de la dinamina 2 causan la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth intermedia dominante. Nat. Gineta. 37, 289–294. https://doi.org/10.1038/ng1514 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Toyota, K. y col. Mutaciones INF2 en la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth complicada con glomeruloesclerosis focal y segmentaria. J. Periférico. Sistema Nervioso JPNS 18, 97–98. https://doi.org/10.1111/jns5.12014 (2013).

Artículo CAS Google Scholar

Hara, M., Ichida, F., Higuchi, A., Tanizawa, T. y Okada, T. Nefropatía asociada con la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth. En t. J. Pediatr. Nefrol. 5, 99-102 (1984).

CAS PubMed Google Académico

Nagano, C. y col. Diagnóstico genético integral de pacientes japoneses con proteinuria severa. Ciencia. Rep. 10, 270. https://doi.org/10.1038/s41598-019-57149-5 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gurel, PS y cols. Corte mediado por INF2 a través del cerco y la interrupción del filamento de actina. actual. Biol. CB 24, 156-164. https://doi.org/10.1016/j.cub.2013.12.018 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Otomo, T., Otomo, C., Tomchick, DR, Machius, M. y Rosen, MK Base estructural de la activación de la formina mDia1 mediada por Rho GTPasa. Mol. Celda 18, 273–281. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2005.04.002 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Mogilner, A. y Rubinstein, B. La física de la protrusión filopodial. Biofísica. J. 89, 782–795. https://doi.org/10.1529/biophysj.104.056515 (2005).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yang, C. y col. Nuevas funciones de la formina mDia2 en la formación de lamellipodios y filopodios en células móviles. PLoS Biol 5, e317. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0050317 (2007).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Descargar referencias

Agradecemos a todos los pacientes y sus familiares que participaron en nuestro estudio. Nos gustaría agradecer a los Dres. Tatsuyo Takahashi y Masaki Miyoshi (Hospital Ajisu Kyoritsu) por brindar información clínica. Este trabajo fue apoyado por las Subvenciones para la Investigación Científica (C) (20K08624 a H. T) y la Investigación Exploratoria Desafiante (24659504 a HT) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia.

Hiroyuki Iida

Dirección actual: Fundación Toyama para la Promoción de Trasplantes, Toyama, Japón

Estos autores contribuyeron igualmente: Hiroko Ueda y Quynh Thuy Huong Tran.

División de Nefrología, Segundo Departamento de Medicina Interna, Universidad Médica de Kansai, 2-5-1 Shinmachi, Hirakata, Osaka, 573-1191, Japón

Hiroko Ueda, Quynh Thuy Huong Tran, Linh Nguyen Truc Tran y Hiroyasu Tsukaguchi

Departamento de Análisis del Genoma, Instituto de Ciencias Biomédicas, Universidad Médica de Kansai, Hirakata, Japón

Koichiro Higasa

Departamento de Genética Molecular, Universidad Médica de Kansai, Hirakata, Japón

Yoshiki Ikeda y Naoyuki Kondo

Departamento de Medicina Legal, Universidad Médica de Kansai, Hirakata, Japón

Masaki Hashiyada

Departamento de Ginecología y Obstetricia, Universidad Médica de Kansai, Hirakata, Japón

Chika Sato

División de Nefrología, Departamento de Medicina, Hospital Fujigaoka de la Universidad Showa, Yokohama, Kanagawa, Japón

Yoshinori Sato

Departamento de Pediatría, Universidad Médica y Farmacéutica de Osaka, Takatsuki, Japón

akira ashida

Departamento de Reumatología, Endocrinología y Nefrología, Facultad de Medicina y Escuela de Graduados en Medicina, Universidad de Hokkaido, Sapporo, Japón

Saori Nishio

Departamento de Nefrología y Medicina de Laboratorio, Universidad de Kanazawa, Kanazawa, Japón

Yasunori Iwata

Departamento de Medicina Interna, Hospital Central de la Prefectura de Toyama, Toyama, Japón

Hiroyuki Iida

Departamento de Pediatría, Facultad de Medicina de la Universidad Shinshu, Matsumoto, Japón

Daisuke Matsuoka y Yoshihiko Hidaka

Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad Médica y Farmacéutica de Osaka, Takatsuki, Japón

Kenji Fukui

Especialidad en Ciencias, Escuela de Graduados en Ciencias e Ingeniería, Universidad de Kindai, Higashiosaka, Japón

Suzu Itami

Departamento de Energía y Materiales, Facultad de Ciencias e Ingeniería, Universidad de Kindai, Higashiosaka, Japón

Norihito Kawashita

Departamento de Pediatría, Facultad de Medicina de la Universidad de Kindai, Osakasayama, Japón

Keisuke Sugimoto

Departamento de Pediatría, Facultad de Medicina de la Universidad de Kobe, Kobe, Japón

Kandai Nozu

Departamento de Nefrología Pediátrica, Universidad Médica Femenina de Tokio, Tokio, Japón

Motoshi Hattori

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También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

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HT concibió y diseñó este estudio y HU, QTHT y HT escribieron el manuscrito. YS, AA, SN, YI, HI, DM, YH, KS, KN, MH, recopilaron información clínica y patológica del paciente. HU, QTHT., LNTT realizaron estudios genéticos, estructurales y de biología celular. KH hizo el análisis de aprendizaje profundo. MH y CS realizaron el análisis de secuencia y apoyaron la interpretación de los datos. YI, KF, SI, NK realizaron el análisis de dinámica estructural y molecular. NK ayudó en los estudios de biología celular. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Hiroyasu Tsukaguchi.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Ueda, H., Tran, QTH, Tran, LNT y col. Caracterización de los efectos citoesqueléticos y estructurales de las variantes de INF2 que causan glomerulopatía y neuropatía. Informe científico 13, 12003 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38588-7

Descargar cita

Recibido: 12 de enero de 2023

Aceptado: 11 de julio de 2023

Publicado: 25 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38588-7

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