Estructura y mecanismo de entrega de ADN propuesto de un roseófago marino.

Jun 03, 2023

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 3609 (2023) Citar este artículo

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Los bacteriófagos con cola (orden Caudovirales) representan la mayoría de todos los fagos. Sin embargo, la cola larga y flexible de los sifófagos dificulta la investigación exhaustiva del mecanismo de administración de genes virales. Aquí, informamos la cápside atómica y las estructuras in situ de la máquina de cola del sifófago marino, vB_DshS-R4C (R4C), que infecta a Roseobacter. El virión R4C, que comprende 12 componentes proteicos estructurales distintos, tiene un vértice quíntuple único de la cápside icosaédrica que permite la entrega del genoma. La posición específica y el patrón de interacción de las proteínas del tubo de cola determinan la cola larga y rígida atípica de R4C y, además, proporcionan una distribución de carga negativa dentro del tubo de cola. Un mecanismo de trinquete ayuda en la transmisión del ADN, que se inicia mediante un dispositivo de absorción que estructuralmente se asemeja a la partícula similar a un fago, RcGTA. En general, estos resultados proporcionan un conocimiento profundo de la estructura intacta y subrayan el mecanismo de entrega de ADN para los sifófagos de importancia ecológica.

Los bacteriófagos, las formas biológicas más abundantes en la biosfera, contribuyen significativamente a dar forma a la diversidad microbiana, mediar el intercambio genético y modular el ciclo de elementos biogeoquímicos1,2,3,4. Todos los fagos conocidos poseen una cápside proteica para la encapsulación del genoma y la mayoría despliega un aparato de cola especializado para reconocer y abrir un punto de entrada en la envoltura celular para la translocación del genoma5,6,7,8. Los fagos con cola (Caudovirales) se pueden clasificar en tres tipos distintos: miófagos, con una cola contráctil (p. ej., T4, Mu); podófago, con cola corta (p. ej., P22, T7); y sifófago, con una cola larga no contráctil (p. ej., SPP1, λ)9.

La mayoría de los fagos con cola tienen una cápside icosaédrica formada principalmente por múltiples copias de las proteínas de la cápside principal (MCP). La primera estructura se resolvió para el sifófago, HK97, y esto identificó un nuevo pliegue proteico denominado pliegue HK97, que posteriormente se encontró en las proteínas de la cápside de varios otros fagos y herpesvirus, a pesar de una baja identidad de secuencia10. En la cápside de los fagos con cola, uno de los cinco vértices es reemplazado por un complejo portal que se conecta a la cola del fago. Los podófagos ensamblan secuencialmente una cola rechoncha en la cabeza completa, mientras que los miófagos y sifófagos tienen distintas vías de ensamblaje de fagos, con sus colas más sofisticadas formadas por múltiples componentes de la cola que interactúan en un orden estricto, conectándose a la cápside del fago a través de un conector de cabeza a cola11. 12. Los sifófagos y los miófagos comparten una maquinaria común de unión de la cola, con dos proteínas básicas de finalización de la cabeza que se distinguen como adaptadores o tapones según si extienden o cierran reversiblemente el portal12,13. Para el ensamblaje de la cola, inicialmente se forma un aparato de absorción, que se dedica al reconocimiento específico y a las interacciones irreversibles con los receptores del huésped (por ejemplo, lipopolisacáridos, ácido teicoico y porinas)14,15,16 y difiere considerablemente en complejidad desde simples fibras de la cola hasta intrincadas construcciones de púas de cola o placas base7,17,18,19. Luego, el aparato prepara la polimerización de la cola cilíndrica, que comprende tres componentes esenciales: un núcleo central construido con anillos apilados de las proteínas del tubo de la cola (TTP) cubiertos por proteínas terminadoras, dentro del cual se colocan las proteínas de la cinta métrica (TMP)11, 20,21,22,23,24. Aunque se han dilucidado ideas aproximadas sobre los mecanismos de transporte de ADN y ensamblaje de virus en fagos, dada la diversidad estructural y genética de las colas de los fagos, los procesos precisos asociados con el ensamblaje de fagos, la infección y el transporte de ADN siguen siendo difíciles de alcanzar para la mayoría de los fagos.

El clado Roseobacter es un grupo dominante de bacterias marinas ampliamente distribuidas en aguas costeras y abiertas, océanos y sedimentos superficiales y profundos, y es importante en el clima biogeoquímico global25,26,27,28. En consecuencia, los fagos que infectan el clado Roseobacter (rosófagos) están muy extendidos en el océano y se consideran factores bióticos importantes que influyen en la biología, la ecología y la biogeoquímica del clado Roseobacter29,30,31. Hasta el momento, se han aislado y secuenciado más de 50 roseófagos pero ninguno se ha caracterizado estructuralmente32. Recientemente caracterizamos un nuevo roseófago, vB_DshS-R4C (R4C)33, que podría infectar al Dinoroseobacter shibae DFL12T, un grupo ubicuo de α-proteobacterias gramnegativas del clado Roseobacter34. El fago R4C es un miembro distinto de la familia de los sifófagos, según lo determinado mediante análisis filogenéticos y genómicos comparativos33.

En este estudio, utilizamos microscopía crioelectrónica (crio-EM) y predicción de estructura para determinar la estructura atómica de la cápside del fago R4C y la estructura in situ de la maquinaria de la cola para caracterizar la distinguida cola larga y rígida. La proteína de la cápside y del tubo de cola se resuelven a resoluciones casi atómicas de 3,63 Å y 3,43 Å, respectivamente. La reconstrucción C12 del complejo portal-adaptador, con una resolución general de 4,7 Å, caracteriza una arquitectura de adaptador que decora un dominio accesorio similar a Ig en su periferia. El patrón posicional específico de la distribución de carga negativa dentro del tubo de cola proporciona evidencia del mecanismo de trinquete previamente identificado que ayuda en la transmisión del ADN35. Además, identificamos un dispositivo de absorción con características estructurales no reportadas previamente para otros sifófagos pero que se asemeja a la de la partícula similar a un fago del agente de transferencia de genes de Rhodobacter capsulatus (RcGTA)36; pero el primero equipa un dominio extraperiférico en la proteína megatrón. En general, nuestro trabajo resuelve y explora en profundidad la estructura intacta y el mecanismo de entrega de ADN de un sifófago de importancia ecológica.

Las imágenes crio-EM sin procesar del fago R4C muestran una cabeza de virus con un diámetro de ~66 nm y una cola larga no contráctil con una longitud de ~110 nm (Figura complementaria 1A). Utilizando estos datos, intentamos determinar la estructura crio-EM de la cabeza de la cápside R4C, resuelta a una resolución general de 3,63 Å mediante análisis crio-EM de una sola partícula (Fig. 1A, Fig. 1 complementaria y Tabla complementaria 1). La capa de la cápside R4C exhibe una red cuasi icosaédrica T = 7 con un diámetro mayor de ~ 664 Å (Figura complementaria 1B). La cápside comprende 415 copias del MCP (vBDshSR4C_006), organizadas en 11 vértices pentónicos y 60 hexones. Luego se construyeron los modelos atómicos de los MCP dentro de una unidad asimétrica que contiene un hexón más un monómero pentamérico (Fig. 1B, C). A través de la superposición estructural, encontramos que la estructura general del MCP R4C es muy similar a la gp5 HK97 a pesar de una identidad de secuencia baja (Figura 2 complementaria, Figura 1D). Similar al HK97-fold canónico, el MCP R4C se compone de un brazo N-terminal largo (brazo N), un dominio de eje (dominio A), un dominio de periferia (dominio P) y un bucle extendido (E -bucle). Las diferencias estructurales entre los MCP de R4C y HK97 se observan principalmente en el dominio A, con bucles de los residuos 155–167 y 202–218 del MCP de R4C desviados hacia adentro en comparación con los de HK97 (Fig. 1D). La superposición de seis copias del monómero MCP hexámero muestra heterogeneidad conformacional, con variaciones estructurales ubicadas principalmente en el bucle E y el brazo N (Figura complementaria 3), lo que contribuye a acomodar el radio deferente en la ubicación deferente de la cubierta de la cápside. Estas variaciones estructurales del bucle E y el brazo N son más notables entre los MCP hexón y pentón; es decir, la subunidad MCP pentamérica tiene una mayor flexión general en su arquitectura con el bucle E girando hacia arriba ~ 16 ° frente al brazo N durante ~ 14 ° (Fig. 1E). Esta desviación estructural da como resultado la formación adaptativa de hexones y pentones reflejados en diámetro y altura. El pentón se presenta con una superficie sobresaliente y más estrecha (altura ~44 Å y diámetro ~130 Å) en comparación con el hexón (altura ~27 Å y diámetro ~148 Å) (Fig. 1F). Tanto el pentón como el hexón se ensamblan mediante patrones de interacción intercapsoméricos similares mediados predominantemente por dos dominios A adyacentes. Es de destacar que el largo bucle E se extiende por la superficie exterior del MCP hacia el dominio P vecino, y la punta del bucle E se une al brazo N distal de otro monómero espaciado, formando una interacción circulante cabeza a cabeza. modo (Fig. 1F); tales interacciones son comunes en la cápside de los fagos37,38,39.

Una reconstrucción icosaédrica de la cápside R4C, coloreada radialmente desde el centro hacia las regiones exteriores del mapa de densidad. B Mapa de densidad de una unidad asimétrica de la cápside (gris transparente) equipada con el modelo correspondiente de los MCP que contienen un monómero pentamericano (naranja) y un hexón (cian). C Los mapas de densidad de sección representativos (malla gris) y los modelos atómicos correspondientes (palos) de MCP ilustran las características de la cadena lateral. D La superposición del MCP R4C y el MCP HK97 (ID de PDB: 1OHG, representado en gris) muestra su conservación y variación estructural. En los paneles superiores izquierdo y derecho se muestran vistas en primer plano de las variaciones estructurales. E La superposición de MCP de pentámero y hexámero muestra la heterogenicidad conformacional en los brazos N-terminales y bucles E. F Las presentaciones en dibujos animados (paneles superiores) de las vistas superiores de un pentón (izquierda) y un hexón (derecha) y las presentaciones de superficies recortadas correspondientes (paneles inferiores) de las vistas laterales muestran su diversidad en altura y diámetro de la superficie sobresaliente.

Para explorar más a fondo la estabilidad estructural del ensamblaje de la cápside R4C, nos centramos en las interacciones intercapsoméricas detalladas. Una red jerárquica de interacciones pentón-hexón y hexón-hexón media el ensamblaje de la cápside R4C (Fig. 2A). Las interacciones pentón-hexón están mediadas principalmente por los dos brazos N antiparalelos de los capsómeros vecinos (Fig. 2B); Este tipo de interacciones también se observan en las interacciones hexón-hexón (Fig. 2C). Además, las interacciones hexón-hexón cerca de los ejes icosaédricos triple y cuasi triple son divisibles en dos capas, en las que están implicados nueve capsómeros de tres hexones diferentes: Las interacciones de la capa interna involucran dominios P ​​de tres capsómeros ubicados más cerca del triple eje. (Fig. 2D), mientras que la capa externa se mantiene mediante interacciones de protuberancias del dominio P, bucles E circulantes de otros tres MCP hexoméricos y tres brazos N de otros MCP (Fig. 2D). Ambas caras laterales de un bucle E en la capa exterior hacen contacto con el bucle G y el bucle P que sobresalen del dominio P interno, mientras que la punta del bucle E, junto con el brazo N vecino, se conecta estrechamente debajo del dominio P, formando una red de enlaces de hidrógeno y puentes salinos para estabilizar las interacciones capsoméricas (Fig. 2E). Es de destacar que la capa de la cápside se estabiliza aún más mediante fuertes interacciones electrostáticas entre las dos capas (Fig. 2F, G). Se observan potenciales electrostáticos positivos en los tres dominios P ​​de la capa interna y en las puntas de los brazos N (Fig. 2F), con cargas negativas observadas en las regiones de contacto de los bucles E de la capa externa (Fig. 2G). Se encuentra una distribución de carga superficial similar en la misma ubicación en RcGTA36 pero no en HK9737 o TW140 (Figura complementaria 4). Además, las superficies de potencial electrostático complementario también son evidentes en las interfaces de las subunidades MCP adyacentes dentro del hexón o pentón (Fig. 2H), a menudo consideradas como un modo de interacción para el ensamblaje de la cápside41,42. Finalmente, los tres bucles P más cercanos al eje triple hacen contacto entre sí y forman un canal con un radio de 3,2 Å, similar al de HK97 (2,9 Å) y RcGTA (4,0 Å), pero más pequeño que ese. en TW1 (6,0 Å) (Figura complementaria 4). Estas interacciones entre bucles E pueden ser débiles o estar abolidas en el fago TW1, lo que puede explicar por qué requiere decoración mediante proteínas adicionales para estabilizar la cápside. En general, múltiples modos de interacción son ventajosos para estabilizar la cápsida de R4C.

Una red Capsomer que contiene las interfaces alrededor de los ejes cinco, tres y dos, como lo indican un pentágono, un triángulo y un óvalo negros, respectivamente. En el análisis de interacción se incluyen una pentona (P1) y cuatro hexones (H1 a H4). Los brazos N antiparalelos están involucrados en las interacciones intercapsoméricas entre las MCP de pentón y hexón (B) y entre dos MCP de hexón (C) mediante extensión a capsómeros vecinos. D, E Los patrones de interacción cerca del eje triple se ven desde afuera. Los detalles de interacción para un tercio de la interfaz en (D) se muestran en (E). Una red de interacción de enlaces de hidrógeno está delimitada por líneas discontinuas amarillas. F Representación de la superficie del potencial electrostático de la misma región que en (D), excepto los bucles E (representación de dibujos animados). El contorno de los E-loops representados por la superficie está resaltado como líneas negras. G Superficies de potencial electrostático de bucles E que se observan mediante una rotación de 180° a través de (F). Se observan potenciales electrostáticos complementarios cerca de las puntas de los bucles electrónicos. H Representación de la superficie del potencial electrostático de dos monómeros MCP hexámeros adyacentes. Los potenciales electrostáticos complementarios ocurren en la interfaz del monómero A (arriba a la derecha) y el monómero B (abajo a la derecha). La escala de potencial electrostático se muestra en la barra de colores (rojo-blanco-azul).

El típico HK97 veces de las MCP también es común entre las proteínas de la cápside de fagos marinos y no marinos. Sin embargo, el análisis del árbol filogenético basado en la estructura muestra que las MCP de fagos de ambientes marinos no forman grupos separados (Figura 5 complementaria), a pesar de su entorno contrastante (p. ej., salinidad, presión osmótica, etc.). Por tanto, los fagos marinos comparten un ancestro común con los fagos no marinos. A diferencia de la cadena reticulada covalentemente presente en la cápside de HK9737, o la formación de una proteína adicional (decoración) para estabilizar las cubiertas de la cápside que se encuentran en los fagos BPP-141, TW140 y Mic38, la cápside R4C se ensambla mediante métodos no covalentes, interacciones intercapsoméricas sin ninguna decoración adicional (Figura complementaria 4). El genoma de la cápside R4C se empaqueta regularmente en capas densas espaciadas uniformemente con una distancia entre capas moderada de ~ 24 Å (Figura complementaria 1B). En comparación con otros caudovirus con T = 7 cabezas de cápside similares, como el bacteriófago T7, lambda, TW1, P47–2637,39,40,43,44,45, R4C tiene una cápside de tamaño normal (diámetro, 600–660 Å) pero alberga un genoma relativamente más pequeño (36 kb, frente a 40, 48 y 83 kb para T7, Lambda y P47-26, respectivamente). Este genoma más pequeño tiene una densidad de empaquetado calculada más baja (0,44 pb/nm 333,46) que la densidad de empaquetado típica de los caudovirus T = 7 (0,54 pb/nm3)47. Por lo tanto, los modos de interacción regulares y simples (es decir, sin cadenas covalentes entrecruzadas ni proteínas decorativas) pueden actuar en conjunto y ser una consecuencia del tamaño del genoma relativamente más pequeño y la menor presión interna en la cápside R4C.

El fago R4C despliega un aparato de cola largo y recto, que no pudo reconstruirse durante la reconstrucción icosaédrica inicial de la cápside viral. Para obtener más información sobre la organización y función de estos componentes que no son MCP, utilizamos una serie de procedimientos de reconstrucción para obtener una estructura intacta del virión R4C (176 nm de largo) con una estructura in situ de la máquina de cola ( 119 nm de largo) (Fig. 3A, B). El vértice portal único, de los 12 vértices quíntuples de la cápside, se clasificó mediante una clasificación enfocada que impone una simetría quíntuple (C5) (Figura complementaria 6A). Una reconstrucción adicional del vértice del portal con simetría C5 y sin simetría (C1) produjo mapas de resolución media del vértice del portal C5 (6,6 Å) y el vértice del portal C1 (11,5 Å) (Figura complementaria 6A). Se definieron otras dos estructuras después de varias rondas de clasificación secuencial localizada y reconstrucción de subpartículas con diferentes máscaras: el portal y adaptador dodecamérica C12 (4,7 Å) y el tapón y terminador C6 (6,6 Å) (Fig. 3B, Fig. Suplementaria). 6A, B). El rastreo de filamentos y la clasificación bidimensional (2D) de la cola R4C identificaron una cola no contráctil, que consta de múltiples capas de discos TTP alrededor de los TMP (Fig. 3C). A través de la reconstrucción helicoidal que impone simetría C6, obtuvimos una densidad de resolución casi atómica del tubo de cola, que reveló un hexámero tubular para un disco (Figura complementaria 6C). Los extremos distales de las colas de R4C se volvieron a extraer y resolvieron imponiendo simetría C3, lo que dio como resultado una estructura de 4,5 Å que contiene una cola distal de C6 (Dit), un módulo de placa base de C3 y tres trímeros de fibra de cola de C3 (Fig. 3B). Figura complementaria 6D). Luego realizamos predicciones de estructura de novo para cada componente de la cola utilizando el servidor trRosetta (esto se debió a su baja similitud de secuencia con las estructuras informadas)48. Todos los modelos predichos se construyeron cuidadosamente de acuerdo con los mapas de densidad y los modelos finales encajaron bien en los mapas correspondientes, lo que permitió una colocación segura de la cadena lateral del tubo de cola y una colocación inequívoca de la columna vertebral de las otras proteínas (Fig. 3D).

A Los mapas de densidad compuestos de la cápside y el aparato de la cola están coloreados con referencia a los componentes proteicos según el mapa genético en (F). Vista recortada de BA de los mapas de densidad de todo el virión que revela información de la estructura interna del genoma (gris), los elementos del vértice portal (rosa), las proteínas de la cinta métrica (TMP, turquesa) y la peptidasa (naranja). La barra de escala corresponde a 10 nm. C Las imágenes de clasificación 2D de toda la cola (arriba), el tubo de cola (centro) y la placa base (abajo). D Para cada subunidad (monómero), el mapa de densidad crio-EM segmentado se muestra en gris semitransparente con el modelo atómico ajustado (cinta). E Vistas superiores del portal (i), adaptador (ii), tapón (iii), terminador (iv), tubo de cola (v), cola distal (vi), complejo cubo-megatrón (vii) y fibras de la cola (viii) del fago R4C. Para los primeros seis polímeros, las subunidades pares e impares se representan en diferentes colores. F Representación esquemática y asignación del módulo genético que codifica las 12 proteínas estructurales de R4C. Los ORF que codifican proteínas no estructurales están coloreados en gris.

En conjunto, informamos que el fago R4C está compuesto por 12 componentes proteicos distintos (596 proteínas en total), incluida una peptidasa no modelada (vBDshSR4C_015) cerca del extremo distal de las TMP (Fig. 3B, E, F, Tabla complementaria 2). Vemos que 415 proteínas principales de la cápside (vBDshSR4C_006) se ensamblan en una cápside icosaédrica, con uno de los cinco vértices formado por 12 proteínas portales (vBDshSR4C_005) incorporándose a 12 proteínas adaptadoras (vBDshSR4C_004). El portal se extiende hacia la cápside y está rodeado por ADN genómico, encima del cual se apila la mayor parte de un ADN desordenado y condensado a lo largo del eje C12 (Fig. 3B). El adaptador se acopla al anillo hexámero de tapón, este último formado por proteínas de tapón (vBDshSR4C_009) que mantienen el ADN dentro de la cápside (Fig. 3B). La cola de 88 nm de largo está compuesta por un anillo hexámero apical de proteínas terminadoras (vBDshSR4C_018); un tubo de cola medio con un total de 120 TTP (vBDshSR4C_010) formando 20 capas de hexámeros; y un anillo hexámero inferior que comprende seis proteínas Dit (vBDshSR4C_013) (Fig. 3B, E). Debajo del Dit está la placa base, que consta de 3 proteínas centrales (vBDshSR4C_014), 3 proteínas megatrón (vBDshSR4C_016) y 9 proteínas de fibra (vBDshSR4C_017) (Fig. 3B, E). La placa base se presenta como un complejo trimérico de centro-megatrón conectado a tres trímeros de proteínas de fibra en forma de garras (Fig. 3A).

Como ocurre con la mayoría de los sifófagos, el conector de cabeza a cola de R4C está compuesto por las proteínas portal, adaptador y tapón organizadas en anillos sucesivos (Fig. 4A). El conector evita la fuga del ADN altamente compactado y proporciona la interfaz de interacción para la unión de la cola del fago (Fig. 4A)11.

Una vista lateral (panel izquierdo) de la interfaz cabeza-cola compuesta por el portal, el adaptador, el tope, el terminador y una capa de tubo de cola. Los modelos de cada subunidad se muestran en cinta y coloreados con referencia al dominio (panel derecho). Una flecha indica el bucle de túnel de la proteína portal. B Vistas en corte de la superficie electrostática del portal (positivo, azul; negativo, rojo). Los dos recuadros muestran los residuos cargados distribuidos en la superficie interior del portal formada por los dominios de la corona (arriba) y el clip (abajo). C Vistas en corte de los mapas compuestos del vértice del portal, que comprenden la cápside y los mapas del genoma que contribuyeron a la reconstrucción de C1, y equipados con las MCP (cian), los mapas del portal y del adaptador contribuyeron a partir de la reconstrucción de C12 y equipados con el proteínas portal (rosa) y adaptadora (púrpura). La densidad del genoma se muestra de forma no transparente y los otros mapas son transparentes. D Tres bucles de la proteína portal implicados en las interacciones con los genomas están resaltados en azul. El mapa de densidad de la reconstrucción C1 revela las interfaces entre la cápside y el portal (E), y la cápside y el adaptador (F); estos estaban mediados por el dominio del ala de la proteína portal (E) y el dominio de unión de la proteína adaptadora (F), respectivamente. G, H Interfaz detallada entre el adaptador (púrpura) y dos proteínas portales (distinguidas por rosa y azul). I, J El ajuste de modelos de la proteína tapón (azul) y dos proteínas adaptadoras (distinguidas por violeta y rosa) en el mapa C6 (superficie transparente) revela una falta de coincidencia de simetría. Los residuos implicados en las interacciones electrostáticas se muestran como barras. K – N Interacciones intra e intercapas en el tapón (diferenciado por azul claro y profundo), terminador (verde claro y intenso) y tubo de cola (amarillo claro y intenso). La interacción entre subunidades de las proteínas de tapón y las proteínas terminadoras se muestra en (K) y (M), con las interfaces entre capas entre las proteínas de tapón y las proteínas terminadoras, las proteínas terminadoras y del tubo de cola se muestran en (L) y (N). , respectivamente. Los elementos estructurales involucrados en las interacciones intra e intercapas se resaltan en diferentes colores.

El complejo portal participa en el ensamblaje de la cabeza, la unión de la cola y el empaquetado y liberación del genoma49,50. La proteína portal R4C, que forma un dodecámero canónico en forma de cono con una altura de 10 nm, muestra una similitud estructural considerable con las proteínas portal de otros fagos, a pesar de la mala conservación de la secuencia (Fig. 4B, Fig. 7 complementaria). La proteína portal, caracterizada de arriba a abajo, comprende dominios separados de corona (residuos 476–551), ala (1–300, 394–475), tallo (301–323, 377–393) y clip (324–376). 51 (figura 4A). El dominio de la corona C-terminal consta de tres hélices α (α9, α10 y α11) conectadas por giros cortos y un C-terminal desordenado adicional de 29 residuos (Fig. 4A). Las hélices α9 que delinean el contorno de la superficie medial en la punta del portal están inclinadas radialmente hacia afuera y se presentan como una abertura en forma de embudo hacia la cápside interna; esto puede facilitar la liberación de ADN (Fig. 4B). Al mismo tiempo, los residuos cargados positiva y negativamente que recubren la abertura α9, incluidos K478, K486, K489, E485 y D479, pueden regular la translocación del ADN (Fig. 4B). El dominio del ala forma la parte central del portal dentro de la cápside, con una hélice α larga y retorcida (α8) que atraviesa todo el dominio del ala del portal y sirve como columna vertebral (Fig. 4A). Un bucle de túnel típico que conecta α8 forma el canal más estrecho con un diámetro de ~30 Å (Fig. 4A, B); una característica estructural análoga (p. ej., los fagos SPP1 y T4) confina el ADN y previene su reflujo desde la cápsida52,53, y el reordenamiento conformacional específico en el bucle del túnel regula la liberación del genoma54. El dominio del tallo comprende principalmente dos hélices α (α5 y α7) que conectan los dominios del ala y del clip (Fig. 4A). El dominio clip, que se extiende a ambos lados de la gruesa pared de la cápside, está parcialmente expuesto fuera de la cabeza de R4C e interactúa con las proteínas adaptadoras (Fig. 4A, C). El residuo K365 del dominio clip induce un anillo cargado positivamente en la superficie interna de la salida del canal (Fig. 4B); en el fago T4, se pensaba que los residuos cargados positivamente en esta posición atraían el ADN durante el período inicial de empaquetamiento del genoma53. Los 31 residuos en el extremo N de la proteína portal R4C están desordenados, pero se presume que están situados alrededor de la superficie exterior del portal, como se sugiere en el fago T4, y estos residuos pueden iniciar un mayor ensamblaje de la cabeza53.

El mapa de densidad C1 del vértice portal presenta fuertes densidades genómicas de ADN terminal a lo largo del eje portal, así como ADN circular y varias capas de ADN genómico (Fig. 4C). Tres regiones en el dominio del ala portal interactúan estrechamente y anclan el ADN genómico a través de residuos cargados positivamente: el motivo RRRLR (residuos 257-274) ancla el ADN circular, como el observado en la cápside del herpesvirus y dicho ADN circular se denominó ADN ancla55 ; R100 y K105 en el bucle de 10 residuos (residuos 99–108) y R453, K458 y K461 en el bucle de 12 residuos (residuos 452–463) del dominio del ala se extienden e interactúan con el ADN genómico en capas (Fig. 4D ). En cuanto a la interacción portal-cápside, el subpliegue α/β en la periferia del dominio del ala descansa cerca de la pared interna de la cápside con una interfaz espaciosa, lo que media un desajuste de simetría de 5 a 12 veces entre el portal y la cápside. cápside (Fig. 4E, Fig. Suplementaria 8A, B).

El complejo portal está cubierto por un adaptador dodecamérica, que se encuentra fuera de la cubierta de la cápside e interactúa tanto con el portal como con las MCP de la cápside (Fig. 4C, F). Actualmente no se ha informado de ninguna proteína que comparta una estructura similar, como lo revela la búsqueda DALI56. Siguiendo la nomenclatura establecida para el adaptador RcGTA, la proteína adaptadora R4C se puede dividir en: dominio de unión (1–106), dominio de tubo (107–130, 149–166), bucle adaptador (131–148) y gancho C-terminal. (167-178) (Figura 4A). El extremo N de la proteína adaptadora es un dominio similar a una inmunoglobulina (Ig) (dominio de unión), y este dominio está conectado al dominio del tubo mediante un bucle largo y flexible (Fig. 4A). Los dominios de unión dodecamérica se identifican en el sentido de las agujas del reloj y muestran una interacción con simetría no coincidente dentro de la cápside R4C alrededor de la simetría quíntuple (Fig. 4F, Fig. Suplementaria 8A, C). El dominio tipo Ig se encuentra en muchas proteínas estructurales diferentes de fagos con cola y puede ser un producto de la transferencia horizontal desenfrenada de genes entre fagos57,58. Los dominios similares a Ig del fago generalmente se clasifican en tres familias distintas de Pfam (la base de datos de familias de proteínas): Big2, I-set y FN3, con funciones propuestas para facilitar la adsorción de fagos y/o aumentar la infectividad59,60. Sin embargo, el dominio de conexión tipo Ig del adaptador R4C no pertenece a ninguna de estas familias. La proximidad del adaptador R4C a la cabeza del fago sugiere que es poco probable que el dominio de unión esté involucrado en el proceso de adsorción durante la infección, sino que se relaciona con la estabilidad conformacional local. El dominio del tubo consta de dos hélices α, con la α2 intercalada entre bucles de proteínas portales adyacentes (Fig. 4G). El dominio del tubo extiende el gancho C-terminal hasta el dominio del clip del portal, formando una red de interacción que comprende cinco láminas β híbridas (Fig. 4H). El bucle adaptador proporciona una interfaz para la unión de las proteínas de tapón.

La proteína tapón, un módulo crucial para el ensamblaje de la cabeza, comparte características estructurales comunes (barril de hebras β antiparalelas) con otros sifófagos, miófagos y entidades similares a fagos (Figuras complementarias 9A, B)61,62. En particular, se pueden especificar dos grupos diversos de proteínas de tapón en función de la ausencia (p. ej., RcGTA g736) o presencia (p. ej., λ gpFII61) de una extensión N-terminal larga que interactúa con las proteínas adaptadoras (Figura complementaria 9A)63. La proteína tapón R4C, con su larga extensión N-terminal, pliega parte del extremo N como una hélice α y desempeña un papel fundamental en la conexión del adaptador (Fig. 4A y Fig. Suplementaria 9A). Específicamente, la hélice α N-terminal de un monómero de tapón forma un contacto cercano con bucles de dos monómeros adaptadores vecinos (pares e impares) (Fig. 4I). Entre ellos, los residuos R145 y K131 de dos adaptadores vecinos, que se ciernen sobre la hélice α del extremo N del tapón, forman una red de puentes salinos con los residuos D7 y D13 de la proteína del tapón (Fig. 4I). Además, se forma otra interacción electrostática entre el residuo D90 de la hebra β del núcleo del tapón y el residuo R141 de la subunidad par adaptadora (Fig. 4J). Varios aminoácidos hidrofóbicos, incluidos tres aminoácidos aromáticos dentro de las hélices del extremo N del tapón, participan en interacciones de apilamiento hidrofóbico con bucles adaptadores adyacentes (Figura complementaria 8D, E). Finalmente, se inserta firmemente un tapón dodecámero de proteínas adaptadoras en un casquillo hexámero de proteínas de tapón, lo que produce un desajuste de simetría entre los dos complejos (Figura complementaria 8A, F).

Curiosamente, el área de contacto entre los topes de R4C (~274 Å2) formada por los extremos N, el bucle corto, el bucle de inserción y β2 parece demasiado pequeña para la formación de complejos (Fig. 4K)64: especulamos que, similar a otros fagos, las proteínas de tapón pueden existir como monómeros en solución y formar el hexámero de tapón cuando se incorporan a la cabeza61,65. Parecido a la gpFII del fago λ, la cola N-terminal del tapón R4C puede ser flexible como un monómero y plegarse en hélices solo cuando interactúa correctamente con las proteínas adaptadoras (Figura complementaria 9A)61. De hecho, dicho cambio conformacional asegura el ensamblaje ordenado de la cabeza del fago completa66,67,68. Después del ensamblaje de la cabeza, el tope R4C engancha su bucle largo para encajar dentro de una ranura formada por el terminador, uniendo la cabeza a la cola preensamblada (Fig. 4L).

Anteriormente, se pensaba que el ensamblaje de la cola en sifófagos y miófagos progresaba a través de un complejo iniciador que funcionaba como un dispositivo de absorción, seguido de la polimerización de los TTP alrededor de los TMP12 y el montaje de una tapa hexámera del terminador en la cola preensamblada en un punto predeterminado. longitud de la cola (definida por TMP) para evitar la polimerización aberrante del tubo de cola11,69,70. Como describimos, el terminador R4C funciona como una plataforma de acoplamiento para la cabeza y la cola preensambladas (Fig. 4A). A pesar de la baja similitud de secuencia, la proteína terminadora R4C comparte una topología estructural común con la de otros fagos de cola larga (p. ej., fago λ gpU11, SPP1 gp1771) e integra elementos de un barril de hoja β multicatenario y dos hélices principales en la periferia (Figs. complementarias 9C, D y 10A). Las hélices α centrales y β3 se adhieren a la superficie del terminador vecino, que está compuesta por una hélice N-terminal, un dominio de inserción y un segmento de β1 (Fig. 4M). La interacción entre el terminador R4C y el tubo de cola se basa principalmente en las puntas de las horquillas β largas del terminador que se unen al surco menor, que está formado por subunidades adyacentes del tubo de cola (Fig. 4N). El residuo M50 en la punta de la horquilla β se inserta profundamente en la cavidad hidrófoba en la interfaz de interacción para estabilizar aún más el acoplamiento de las capas (Figura complementaria 10B).

Los sifovirus suelen poseer colas largas, no contráctiles y flexibles que son difíciles de caracterizar estructuralmente. Por el contrario, la cola intrínsecamente rígida de R4C, que se presenta como una estructura tubular larga y recta de 20 capas de TTP (Fig. 3A, B), favorece la elucidación estructural. Se obtuvo un mapa de densidad del tubo de cola con una resolución de 3,43 Å mediante reconstrucción helicoidal. El mapa mostraba una arquitectura en espiral con una elevación axial de ~40 Å y una torsión de 30° (Fig. 5A). Luego resolvimos el modelo atómico de TTP (Fig. 5B, C), encontrando conservación en los cuerpos principales de TTP entre R4C, SPP1, T4 y RcGTA, con un sándwich β retorcido similar que extiende una horquilla β larga (Fig. 5C). , Figura complementaria 9E, F). Estos hallazgos apuntan a una notable conservación de las TTP dentro de sifófagos, miófagos y otras partículas similares a fagos36,72,73.

Se muestra una representación de superficie AA del mapa crio-EM de 3,43 Å de las proteínas del tubo de cola de cuatro discos (TTP), resaltando una hebra helicoidal de TTP en azul. Se indican el ascenso y la torsión helicoidales. B Mapas representativos de densidad crio-EM (malla) y modelos atómicos correspondientes (palos). C Las vistas lateral (panel izquierdo) y superior (panel derecho) de una subunidad individual del TTP se muestran en representación de cinta con las hélices α y las hebras β coloreadas en rojo y turquesa, respectivamente. Las cadenas β están numeradas secuencialmente (β1–8). D Vista lateral del tubo de cola (4 discos) con la mitad superior delantera dividida y se muestra la distribución de carga electrostática en las superficies exterior e interior. Positivo (azul), negativo (rojo), neutro (blanco). Los diámetros exterior e interior del tubo de escape están etiquetados. E Posiciones relativas e interacciones de los TTP adyacentes del mismo disco y de dos discos consecutivos. El bucle largo (amarillo) se extiende por debajo y contacta con el barril β central de la subunidad vecina (azul) del mismo disco y las subunidades inferiores (blanca y gris) del siguiente disco. F – H Detalles de las interacciones entre las subunidades TTP de un disco. Dos subunidades adyacentes están estabilizadas por una red de enlaces de hidrógeno entre cadenas (F) y dos redes de puentes salinos (G, H), como lo indican las líneas discontinuas verdes y naranjas, respectivamente. I – K Detalles de las interacciones entre subunidades TTP de dos discos consecutivos. Las interacciones son aportadas principalmente por interacciones no polares, como lo muestra la línea discontinua violeta. Para mayor claridad, la molécula que muestra los residuos no polares clave se representa en una representación de cinta, mientras que las otras moléculas que forman la bolsa hidrófoba se representan en una representación de superficie molecular. Las superficies hidrófobas están en amarillo y las superficies cargadas en turquesa. Las cadenas laterales de los residuos seleccionados están representadas en forma de barra.

El tubo de cola helicoidal tiene un diámetro exterior de ~85 Å y un amplio corredor interior de ~43 Å que muestra un fuerte potencial electrostático negativo (Fig. 5D), como se observa en otros TTP, y probablemente facilita el tráfico de ADN hacia el huésped74. Los residuos de aspartato (p. ej., D27 y D108) y glutamato (p. ej., E32 y E57) que recubren el túnel forman una pista helicoidal casi paralela, cargada negativamente, a través del tubo de cola (Figura 11A complementaria), con una separación equidistante de ~16 Å (Figura 11A complementaria). Figura 11B). Dado que este valor está cerca del espaciado medio de los surcos mayores y menores del ADN, especulamos que el ADN queda confinado entre las pistas y, por lo tanto, puede migrar rápidamente a lo largo de la trayectoria helicoidal derecha debido a la repulsión electrostática durante la translocación del ADN. También se ha propuesto un mecanismo de trinquete análogo para el fago YSD1, que trinquetea el ADN a través de una torsión helicoidal inherente al polinucleótido35. Esta peculiar característica molecular puede potenciar la velocidad migratoria del genoma, ya que se calculó que la fuerza impulsora inicial para la liberación del genoma (proviene de la presión de turgencia interna) solo podía dilucidar la entrada de ~15% de la longitud del genoma41,42,43.

Las interacciones entre monómeros dentro del mismo disco TTP están dominadas por enlaces de hidrógeno de la columna vertebral entre las capas de la hoja β, con dos redes electrostáticas para la unión asistida (Fig. 5E-H). Específicamente, β5 de un TTP interactúa con β2 de la subunidad adyacente, formando una lámina β antiparalela y una extensa red de enlaces de hidrógeno (Fig. 5F). Esto da como resultado una estructura de barril β integrada de 24 hebras para un disco del tubo de cola. Los residuos cargados negativamente (es decir, D67, E103 y E70) se acoplan con residuos cargados positivamente de la subunidad adyacente (es decir, R91 y K126) estableciendo una densa red de puentes salinos (Fig. 5G). Otra interacción electrostática la forma R118 de una subunidad que entra en contacto con E43 y E32 del bucle largo de la subunidad adyacente (Fig. 5H). Las interacciones entre capas implican interacciones hidrófobas extensas, con el bucle largo de TTP en la capa superior interactuando con tres TTP de las capas inferiores del disco (Fig. 5E). El residuo T48 y dos residuos hidrofóbicos de bucle largo, F46 y V33, entran en contacto con la superficie hidrofóbica formada por las dos primeras subunidades (Fig. 5I). La cadena lateral M38, que se asemeja a la M50 de la proteína terminadora (Fig. 10B complementaria), se inserta en el bolsillo hidrofóbico formado por las dos subunidades anteriores (Fig. 5J), y la voluminosa cadena lateral aromática de W36 del bucle largo se intercala. por V49 y K107 de los discos superior e inferior, respectivamente, para estabilizar aún más las interacciones entre capas (Fig. 5K).

Los TMP R4C, que muestran solo densidades borrosas en la reconstrucción helicoidal del tubo de la cola, se ubican en la luz del conducto de la cola y pueden existir como un trímero74,75. Las predicciones de la estructura secundaria sugieren que R4C TMP comprende un motivo hélice-hoja-hélice similar al encontrado en RcGTA (Figura complementaria 12A)36. El extremo N-terminal de TMP predicho tiene una hélice α hidrófoba larga de 517 residuos y, tras la formación de un trímero, forma un núcleo enrollado de triple hebra (Fig. 12A, B complementaria). Se supone que el dominio C-terminal de R4C TMP que sigue comparte una topología comparativa con la aguja de la cola de los fagos P22 y HK60, que comprenden la triple hélice β y las hélices α cortas invertidas (Figura complementaria 12A, C)76 ,77. R4C TMP desempeña un papel funcionalmente crítico durante la translocación del ADN. Dos segmentos transmembrana de hélice α continuos (residuos 277–303, 309–327) que se encuentran en el medio del TMP R4C (Fig. 12A y 12D complementarias) pueden formar un canal que abarca la envoltura bacteriana para evitar la degradación genómica por endonucleasas periplásmicas78. Se observan actividades de asistencia de TMP similares en otros fagos (p. ej., TP901-179 y T46). Se cree que el aparato integrado C-terminal está involucrado en la penetración de la membrana y la estabilización estructural76. Además, se infiere que la peptidasa, que causa la degradación del peptidoglicano80, reside junto al dominio C-terminal de TMP36 (Figura complementaria 12C).

Estábamos intrigados por qué el fago R4C aparece como una cola larga y recta y buscamos explorar su resiliencia estructural mediante simulación de dinámica molecular (MD). Se implementó un MD de dos pasos en el tubo de 7 discos de longitud desalojado de la cola R4C, la cola de otro fago SPP172 con una longitud comparable para el tubo de 7 discos y, por lo demás, mayor flexibilidad sirvió como control. Primero se empleó la MD dirigida (SMD) para inducir la flexión de los tubos en cuatro direcciones representativas contra el eje de la cola (Figura complementaria 13A), y luego se calculó la MD convencional (CMD) en los tubos doblados después de levantar la fuerza SMD (Figura complementaria 13A). 13B, C). Los resultados demostraron que la cola de R4C casi podría recuperar su forma recta original después de una simulación CMD de 10 ns en cualquiera de las cuatro direcciones, mientras que la cola de control SPP1 permanece sin cambios en el gesto de flexión (Figura complementaria 13D), lo que sugiere que la cola de R4C puede tener un excelente Resiliencia para mantener la forma recta en el entorno nativo. Por otro lado, nos preguntamos si la naturaleza compacta del apilamiento de capas de simetría séxtuple contribuiría a la resiliencia estructural de la cola de R4C. Se aplicó el MD que utiliza el modelo basado en estructura (SMOG) en lugar de CMD para simular el proceso de flexión del tubo R4C doblado inducido por SMD. El modelo SMOG se construye en términos de propiedades dependientes de la estructura de conjuntos de una sola molécula o de múltiples moléculas, al tiempo que filtra los efectos relacionados con las interacciones intra o intermoleculares81. Curiosamente, la cola de R4C permanece sin cambios en el ángulo de flexión después del MD basado en SMOG, lo que revela que la resiliencia de la cola de R4C se atribuyó a interacciones moleculares en lugar de apilamiento de moléculas (Figura complementaria 13E).

La reconstrucción estructural del punto final de la cola es un desafío debido a su baja identificabilidad y orientación preferida en imágenes crio-EM. Sin embargo, pudimos capturar algunas clases 2D que muestran las características típicas de la placa base durante la reconstrucción helicoidal del tubo de cola (Fig. 3C), lo que indicó que el punto final de la cola también se seleccionó del procedimiento de trazador de filamentos. La reconstrucción de estas partículas que imponen simetría C3 dio como resultado un mapa de resolución de 4,5 Å que permitió la construcción del modelo de columna vertebral de Cα al final de la cola del fago R4C (Figura complementaria 6D).

La cola distal de R4C (que une el tubo de cola hacia arriba y la placa base hacia abajo) es un hexámero C6, como lo revela la reconstrucción de C3. Cada proteína Dit se puede dividir estructuralmente en dos dominios: el dominio central se presenta como una estructura β-sándwich retorcida con dos horquillas β y dos hélices, mientras que el dominio de inserción que sobresale hacia afuera de la superficie del tubo está organizado en un pliegue en forma de barril y decorado con dos bucles de inserción (Fig. 6A, B). El dominio central que alberga el canal central proporciona sitios de unión para el tubo de cola y la placa base (Figura complementaria 14A). Ambos dominios del monómero Dit median interacciones entre subunidades. El β1 y los dos bucles de inserción forman una muesca para sujetar el α2 del monómero adyacente, asegurando resistencia a la asociación del hexámero (Figura complementaria 14B). Los bucles cortos de dos monómeros adyacentes y los bucles α1 y β2-α2 interactúan con el bucle largo de un monómero del tubo de cola (Figura complementaria 14C). El bucle largo Dit adopta un cinturón de horquilla β en forma de L para crear una superficie flexible para una unión óptima de la placa base, mediando el desajuste de simetría entre el hexámero C6 Dit y el complejo megatrón-hub C3 (Figura complementaria 14D, E).

Un mapa de densidad C3 filtrado gaussiano de la cola distal y la placa base se representa en una superficie blanca semitransparente y los modelos correspondientes se muestran y colorean según los componentes proteicos. B Modelos de cada componente codificados por colores por dominio. El dominio del clip indeterminado está marcado en texto gris. C Detalle de un grupo de hierro y azufre coordinado por cuatro Cys de la proteína central. Se muestra la fuerte densidad (malla gris) correspondiente al grupo hierro-azufre. D Vista de cabeza a cola del mapa de densidad de la placa base con los dominios de iris/penetración de las proteínas megatrón marcados con una flecha roja. El panel derecho muestra una vista en primer plano de la hélice α N-terminal de los dominios de penetración/iris de tres proteínas megatrón que encajan bien en las densidades de la puerta similar al iris, con una de las hélices resaltada en rojo. Se representa el diámetro interior (~10 Å) del túnel.

El dominio central de Dit es estructuralmente homólogo al de RcGTA y el fago T5 (RcGTA: puntuación Z del análisis DALI = 8,4, identidad de secuencia = 36%; T5: puntuación Z = 7,3, identidad de secuencia = 6%), lo que sugiere su relación evolutiva (Suplementario Figura 9G, H)36,82. Se considera que el dominio de inserción Dit de RcGTA es homólogo al del fago T5, que adopta un pliegue de unión de oligosacárido/oligonucleótido (tipo OB) y proporciona propiedades de adhesión al huésped36. Sin embargo, no observamos ninguna similitud estructural para el dominio de inserción Dit de R4C; en cambio, se parece al extremo N del dominio más externo de la proteína de la fibra de la cola del fago T7 (Figura complementaria 15E)83. Los análisis PSI-BLAST y Pfam confirman asociaciones entre la proteína R4C Dit y proteínas pertenecientes a la familia de las glucósidos hidrolasas, que pueden capturar sacáridos84. A diferencia de T5 Dit, especulamos que R4C Dit funciona como un aparato de adsorción de cola, reconociendo los diferentes receptores/componentes de la pared celular.

La placa base C3 se ensambla en el extremo distal de la cola R4C (Fig. 3A). La placa base general de R4C es homóloga a la de RcGTA y ambas comprenden proteínas hub (35,5% de identidad de secuencia), megatrón (39,6% de identidad de secuencia) y fibra (30,4% de identidad de secuencia) (Fig. 6A, B). Según la nomenclatura establecida, la proteína central R4C es divisible en cuatro dominios: dominios de unión (1–141), de unión a iones (142–161, 244–266), de unión a oligosacáridos (162–243) y de clip (267– 291) (Figura 6B). El dominio de inserción presenta una interfaz de acoplamiento predominante para la cola distal (Figura complementaria 14D, E). El dominio de unión de iones, que comprende dos segmentos discretos, utiliza cuatro residuos de Cys conservados para coordinar un grupo de hierro-azufre (Fig. 6C), que es esencial para el ensamblaje de la cola y la actividad biológica de los fagos85. El dominio de unión a oligosacáridos puede surgir a través de la transferencia horizontal de genes, y la propiedad de unión a sacáridos (presumiblemente específica del huésped) mejora la adhesión celular.

La proteína megatrón se divide en seis dominios: iris/penetración (1–45), similar a adhesión (46–211), periférico (212–481, 630-903), unión a carbohidratos (482–629), central (904 –1130) y dominios de unión a fibras (1131-1447) (Fig. 6B). El dominio de iris/penetración es muy flexible, excepto por sus hélices α1 N-terminales, que corresponden a una densidad notable dentro del canal de la placa base (Fig. 6D). Las tres hélices α1 de las tres proteínas megatrón forman una puerta similar a un iris en un estado cerrado (diámetro interior, ~10 Å) que se asemeja a la de RcGTA36; esta estructura ayuda a prevenir la erupción del ADN genómico. El dominio iris/penetración permite la formación de hélice transmembrana (Fig. 15A, B complementaria), que puede funcionar para penetrar la membrana externa y crear un poro para el transporte de carga. Especulamos que tanto las hélices del megatrón que atraviesan la membrana como las TMP crean el canal transmembrana para la translocación del ADN a través de las diferentes capas de la membrana bacteriana. El dominio central, que comparte la misma topología que el dominio central de la cola distal, participa principalmente en la unión de la cola distal (Figura complementaria 14D, E). Debajo del dominio central está el dominio similar a adhesina, donde termina el túnel de cola. El dominio similar a una adhesión es parcialmente muy flexible e incluye un bucle desordenado (residuos 95 a 113) (Figura complementaria 15A, C). Evolutivamente, se predice que el dominio periférico se plegará en una estructura similar a la mananasa (Figura complementaria 15F, G). Además, en comparación con RcGTA, se encuentra un dominio adicional que se extiende más allá del dominio periférico (Figura complementaria 15A). Designamos este dominio como dominio de unión a carbohidratos, ya que comparte una topología similar con el módulo de unión a carbohidratos de Clostridium thermocellum (CtCBM11), que une varios poli y oligosacáridos (Figura complementaria 15H, I)86. Por último, el dominio de unión a fibras en la parte inferior consta de tres regiones separadas: dos proporcionan una interfaz para la unión de proteínas de fibra, mientras que la tercera puede estar comprometida para mantener la base de la placa base en un estado metaestable (Fig. 6B). .

Cada uno de los tres complejos de fibras triméricas en forma de trípode está formado por una combinación de tres monómeros de fibras de la cola, en los que las regiones de la cabeza (1–35), el cuerpo (36–117) y los pies (118–230) se denominan los dominios de varilla, perilla y pie, respectivamente (Fig. 6A, B). El dominio de varilla es un dominio en espiral con una extensión N-terminal que se une al dominio de unión a fibra megatrón (Fig. 6B). El dominio de perilla conecta la varilla con el pie C-terminal, que es un dominio rico en lámina β con un pliegue similar a una lectina (un barril beta antiparalelo de 8 hebras), capaz de unirse a carbohidratos (Fig. 6B). 87.

Muchas bacterias marinas, incluidas las roseobacter, producen polisacáridos capsulares para mejorar su competencia y adaptación a los ambientes marinos88,89; esto proporciona simultáneamente una gran cantidad de carbohidratos para el reconocimiento de los fagos. En consecuencia, el fago R4C equipa varios accesorios de unión a carbohidratos, incluido el dominio de inserción Dit, los dominios periféricos y de unión a carbohidratos del megatrón, el dominio central de unión a oligosacáridos y el dominio de pie de fibra para unirse a la cápsula bacteriana. Estos componentes estructurales específicos son esenciales para la infección por fagos al facilitar el anclaje del huésped bacteriano.

Se cree que el GTA se origina a partir de (pro)fagos según el análisis genómico, en particular genes que codifican proteínas relacionadas con la cola90,91. Observamos una alta similitud estructural entre las proteínas relacionadas con la cola de R4C y RcGTA: esto proporciona más evidencia de la correlación evolutiva entre GTA y los bacteriófagos y nos permite proponer una perspectiva ecológica para su relación. La expresión y secreción de GTA las realizan bacterias para mantener la población huésped90,91. Los genes que codifican GTA en el huésped se pueden obtener a partir de fagos, ya que las integrasas (enzima integradora) y los represores permiten que los fagos integren sus genomas en los genomas del huésped, lo que permite al huésped adquirir genes rentables de los fagos para la producción y evolución de GTA. Sin embargo, el análisis filogenético muestra que los genes GTA en D. shibae DFL12 y sus genes de fagos específicos, incluidos los de R4C, no están estrechamente relacionados (Figura complementaria 16), lo que sugiere una evolución separada en bacterias y fagos.

Recíprocamente, bajo ciertas circunstancias, los fagos pueden obtener genes que codifican GTA del huésped. La mayoría de las proteínas relacionadas con la cola del fago R4C demuestran conservación estructural y posible funcional con el GTA, de la cual los fagos pueden beneficiarse. Más específicamente, las buenas condiciones de crecimiento de la bacteria huésped92,93, que son críticas para una alta expresión y secreción de GTA, también son adecuadas para la infección y producción viral. Por otro lado, la transferencia horizontal de genes mediada por GTA ocurre mucho más ampliamente (en todo el filo) que su rango de huéspedes94, lo que implica que GTA puede ingresar a una gama más amplia de bacterias. Con estas consideraciones en mente, los roseófagos, como el R4C, que tienen mecanismos similares de unión, adsorción, entrada y entrega de ADN, pueden tener el potencial de ganar la carrera armamentista evolutiva entre virus y huéspedes y mostrar una mayor ventaja ecológica sobre otros fagos.

Con base en la estructura in situ del virión R4C intacto, junto con nuestro análisis comparativo de proteínas virales y sus estructuras homólogas, proponemos un mecanismo de administración de ADN del fago R4C (Fig. 7). Suponemos que el fago R4C se adhiere primero a la bacteria huésped estableciendo interacciones con el receptor bacteriano específico (p. ej., polisacáridos capsulares) o sus cofactores utilizando los dominios adicionales de las proteínas de la cola distal y/o las proteínas megatrón (Figura complementaria 15A). ). Las tres proteínas de fibra trimérica funcionan como anclajes y orientan el fago, luego impulsan la placa base hacia la membrana externa para unirse firmemente a la bacteria huésped. Luego se producen reordenamientos conformacionales en cascada dentro de la placa base, e incluso en toda la cola, para desencadenar aún más la apertura del túnel de la cola desde su estado cerrado. De ahora en adelante, los extremos N hidrofóbicos de las proteínas megatrón, que forman el pestillo (Fig. 6D), se exponen y luego se insertan en la membrana externa de la bacteria para formar un poro transmembrana. La liberación de la peptidasa conduce entonces a la degradación de la capa de peptidoglicano entre las membranas externa e interna de la bacteria. Las TMP salen de la cola y entran en el espacio periplásmico, presumiblemente atravesando la envoltura de la célula bacteriana y formando un conducto a través de la membrana interna utilizando sus segmentos transmembrana (Figura 12 complementaria); este transporte puede requerir la ayuda de proteínas transportadoras de glucosa78. La salida de TMP puede, a su vez, desencadenar la transducción de señales desde el terminador al portal, que aparece como una serie de cambios estructurales secuenciales (p. ej., el bucle del túnel del portal) que finalmente inician la translocación del genoma. La presión almacenada en la cabeza del fago impulsa el ADN genómico hacia el canal del tubo de la cola, pero esto puede ser insuficiente para mover el genoma completo contra la presión osmótica interna de la célula bacteriana95,96. El seguimiento con carga negativa en la superficie interior del tubo de cola (Figura 11 complementaria), complementado con su arquitectura tubular recta (Figura 5), ​​ayudará al paso del ADN a través de la cola larga. Finalmente, el genoma es expulsado hacia la bacteria huésped cruzando el canal formado por las TMP.

A El virión R4C maduro. B El virión R4C reconoce y se une al receptor o cofactor del huésped a través de su placa base o proteína de la cola distal. C Las proteínas de la fibra de la cola permiten que R4C se una aún más a la superficie del huésped utilizando su eje de la cola. D Penetración de la membrana externa por la proteína megatrón iris/dominio de penetración. E Degradación de la capa de peptidoglicano del huésped por la peptidasa de la pared celular. F Las proteínas de la cinta métrica (TMP) se liberan y forman un canal a lo largo de la membrana del huésped. G Eyección del genoma al citoplasma del huésped a través del canal TMP. H La partícula vacía de R4C.

En resumen, la liberación del genoma de R4C, así como de otros fagos con cola, se logra mediante un proceso colaborativo complejo mediado por varias proteínas estructurales. Es necesario descubrir más detalles adicionales para completar el procedimiento.

La bacteria huésped D. shibae DFL12 se cultivó a 28 °C en medio RO (1 g/l de extracto de levadura, 1 g/l de peptona y 1 g/l de acetato de sodio a pH 7,5), con agitación a 160 rpm. El stock vB_DshS-R4C en tampón SM (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM y MgSO4 8 mM) se añadió a DFL12 cuando la DO600 del huésped era igual a 0,2–0,3. Después de 24 h de infección, el lisado se centrifugó a 8000 rpm durante 10 minutos y se filtró a través de una membrana de policarbonato de 0,2 μm (Merck Millipore), y la fase acuosa se precipitó con polietilenglicol (PEG) 8000 disuelto al 10 % (p/v). y NaCl (1 M) a 4 °C durante 30 h. Luego, la mezcla se centrifugó a 10.000 x g durante 50 min a 4 °C y el sedimento se resuspendió suavemente en 5 ml de tampón SM y se purificó con un gradiente de densidad de CsCl2 (1,3 mg/ml, 1,5 mg/ml, 1,7 mg/ml). ml; 34100 × g, 4 °C, 24 h). Las partículas de fagos purificadas se recogieron y se dializaron dos veces con tampón SM durante la noche en la oscuridad a 4 °C.

Se cargaron alícuotas de 3 µl de fago R4C purificado en rejillas Quantifoil de carbono con descarga luminosa (60 s a 20 mA) (R1.2/1.3, malla 200, Quantifoil Micro Tools) usando un Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific) a 100% de humedad y 4°C. Los datos se adquirieron en un microscopio electrónico de transmisión FEI Tecnai F30 (Thermo Fisher Scientific) operado a 300 kV y equipado con un detector de electrones directo Falcon 3. Las imágenes se grabaron en el modo de película de 39 fotogramas con un aumento nominal de ×93.000 y un tamaño de píxel de 1,12 Å. La dosis total de electrones se estableció en 30 e− Å−2 y el tiempo de exposición fue de 1 s. Los datos se recopilaron automáticamente con el software Thermo Fisher EPU.

La corrección del movimiento inducido por la deriva y el haz se realizó con MotionCor297 para producir una micrografía de cada película. El ajuste de la función de transferencia de contraste (CTF) y la estimación del cambio de fase se realizaron con Gctf98. Se descartaron las micrografías con astigmatismo, deriva evidente o contaminación. Los siguientes procedimientos de reconstrucción se realizaron utilizando Cryosparc V399. En resumen, las partículas de la cabeza de R4C se recogieron automáticamente usando el "selector de gotas" y luego el "selector de plantillas", mientras que el "trazador de filamentos" se usó para la cola cilíndrica de R4C para facilitar la recolección de partículas de densidad a lo largo del eje de la cola. Varias rondas de clasificaciones 2D sin referencias en dos conjuntos de datos arrojaron dos tipos distintos de clases, de las cuales una representaba el tubo de cola y la otra, la cola distal de la cola R4C. Las partículas buenas seleccionadas de la cápside y la cola distal se sometieron a reconstrucción ab-initio y refinamiento homogéneo imponiendo simetría I2 y C3, respectivamente. Las partículas del tubo de cola se sometieron a varias iteraciones de reconstrucción helicoidal y al proceso de búsqueda de simetría para determinar con precisión la simetría, la elevación y la torsión de la cola helicoidal, obteniendo finalmente el mapa de densidad. La resolución de los mapas de densidad para la cápside y el tubo de cola se determinó mediante la curva de correlación de la capa de Fourier estándar de oro, con un límite de 0,143100. La resolución del mapa local se estimó con ResMap101.

Las imágenes preprocesadas en Cryosparc se importaron a Relion 3.1 para una reconstrucción adicional del cuello R4C. Brevemente, se recogieron manualmente cientos de partículas del cabezal R4C y se sometieron a una clasificación 2D (bin2), y se utilizaron los promedios de clase 2D mejor definidos para seleccionar automáticamente las partículas en todas las micrografías. Se realizaron clasificación 2D y refinamiento 3D (bin2) para obtener la reconstrucción I3 de la cápside. Luego se extrajeron 14,776 partículas (bin1) y se sometieron a la expansión de simetría en Relion usando simetría I3. Se volvieron a extraer subpartículas de los quíntuples vértices; los que representan el vértice portal C12 se clasificaron mediante clasificación 3D imponiendo simetría C5. Para determinar las proteínas del cuello, se realizaron clasificaciones adicionales de simetría expandida (C5) y 3D (C12), lo que produjo cinco clases del vértice portal con diferentes orientaciones globales que difieren en 72°; Todas estas cinco clases presentaron una característica típica del portal y adaptador dodecamérico. Con base en partículas de una de las cinco clases, se llevaron a cabo reconstrucciones de subpartículas localizadas usando diferentes simetrías y máscaras para obtener los mapas de densidad del vértice portal C1, el vértice portal C5, el vértice portal C6 y el vértice portal C12, respectivamente. .

El modelo inicial del MCP R4C se generó a partir de un modelado de homología basado en el modelo atómico del MCP de HK97 (PDB ID: 1OHG) mediante el software Accelrys Discovery Studio (disponible en: URL: https://www.3dsbiovia.com). Para los componentes de la cola, sus secuencias se sometieron al servidor de predicción de la estructura de proteínas trRosetta (disponible en URL: https://yanglab.nankai.edu.cn/trRosetta/)48, y los modelos predichos sirvieron como modelo inicial para un mayor refinamiento. Inicialmente ajustamos las plantillas en los mapas crio-EM finales correspondientes usando Chimera102; en detalle, las proteínas de la cápside se colocaron en el mapa de la cabeza I2, las proteínas portal y adaptadora en el mapa del cuello C12, las proteínas tapón y terminador en el cuello C6. mapa, las proteínas del tubo de la cola en el mapa de la cola C6, el complejo de la placa base, la cola distal y las proteínas de la fibra de la cola en el mapa base C3, respectivamente. Todos los modelos fueron corregidos y ajustados manualmente mediante refinamiento en espacio real en Coot103. Como el cuello y la base de R4C exhibían densidades débiles, construimos los modelos de columna vertebral solo para proteínas de fibra de portal, adaptador, tapón, terminador, cola distal, megatrón, centro y fibra de cola. Para las principales proteínas de la cápside y del tubo de cola, los modelos resultantes se refinaron aún más con phenix_real_space_refine en PHENIX104. Estas operaciones se ejecutaron de forma iterativa hasta que las regiones problemáticas, los valores atípicos de Ramachandran y los rotadores deficientes fueron eliminados o trasladados a regiones favorecidas. La totalidad de estas siete unidades asimétricas de cápside fueron sometidas a un mayor refinamiento en el espacio real para optimizar los enfrentamientos. Los modelos atómicos finales se validaron con Molprobity105,106. La alineación de la secuencia se realizó con Clustal Omega en el servidor EBI (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Todas las figuras fueron generadas con Chimera o ChimeraX107,108.

Se emplearon por primera vez simulaciones de dinámica molecular dirigida (SMD), que sirvieron como herramienta de construcción de modelos para generar artificialmente una estructura doblada de los tubos de cola de R4C y SPP1. Las estructuras finales extraídas de las simulaciones SMD se sometieron a MD convencional (CMD), eliminando la fuerza para estimar la elasticidad de la cola siguiendo los cambios del ángulo de flexión del tubo de cola correspondiente. Para lograrlo, se utilizaron modelos atómicos compuestos por siete discos de las proteínas del tubo de cola R4C y SPP1 (PDB ID: 6YQ5). Los modelos preparados se enviaron a Autopsf en VMD109 para generar información de topología. La estructura se incrustó en la caja explícita de disolvente (agua) que abarca 12 Å del límite de la proteína utilizando el modelo de potencial hídrico TIP3P (potencial intermolecular transferible con tres sitios de interacción)110. El sistema se neutralizó agregando iones de contracloruro para lograr una carga cero, seguido de iones de sodio y cloruro adicionales hasta una concentración fisiológica final de 0,15 M. Aplicamos el campo de fuerza CHARMM36 en nuestra simulación y se emplearon condiciones de contorno periódicas para evitar un efecto de borde.

Los dos sistemas preparados se sometieron a simulación SMD con la fuerza aplicada a los átomos de CA de las cinco capas intermedias del tubo de cola de siete discos. Las fuerzas aplicadas disminuyen desde la capa intermedia a ambas capas flanqueantes para inducir una curvatura continua. La fuerza aplicada a las capas intermedias se fijó en 2,08, 1,38 kcal/mol/Å para las capas 3.ª/5.ª y 0.69 kcal/mol/Å para las capas 2.ª/6.ª. Se indujo que el tubo de cola se doblara en cuatro direcciones representativas (0°, 15°, 30°, 45°) entre dos subunidades (con un intervalo de 60°) de la capa de simetría séxtuple, las direcciones estaban contra el eje de la cola (Figura complementaria. 13A). De estos, la dirección a 0° apunta desde el centro de masa (COM) de una cadena al de la cadena opuesta. Cada simulación SMD se realizó con una duración de 150 picosegundos (ps) y luego se emplearon simulaciones CMD adicionales de 10 nanosegundos (ns). Cada simulación CMD se repitió cinco veces. El ángulo de flexión que refleja la forma del tubo de 7 discos fue definido por los tres puntos, que corresponden a los COM de las capas superior, media e inferior del tubo. La posible variación de los ángulos de flexión se controlará en todo el MD.

Las simulaciones MD se realizaron utilizando el paquete MD NAMD versión 2.13111. El paso de tiempo de integración de la simulación se estableció en 1 femtosegundo (fs) y las coordenadas de posición (archivo DCD) se guardaron cada 0,2 ps para SMD y 4 ps para CMD, para su posterior análisis. Las interacciones electrostáticas periódicas de largo alcance se evaluaron utilizando el método Smooth Particle-Mesh Ewald (PME)112, con un radio de corte real de 10 Å. Las longitudes de todos los enlaces químicos que involucran enlaces de hidrógeno fueron restringidas por el algoritmo SHAKE113. Las simulaciones CMD se realizaron a 310 K y la temperatura constante se controló mediante la dinámica de Langevin114 bajo una presión de 1 atm115 mantenida usando el termostato Nose-Hoover. El control de temperatura constante se apagó en SMD para disminuir la libertad de los átomos. Antes de cada producción, se minimizó la energía del sistema mediante 2000 pasos de gradientes conjugados para reducir los conflictos estéricos entre las moléculas de agua y la proteína. Los resultados dinámicos se analizaron utilizando el programa VMD.

La simulación basada en SMOG de todos los átomos, un modelo centrado en los nativos que conserva todos los detalles estructurales atómicos, se realizó para explorar el peso de la estructura molecular que contribuyó a la resiliencia de la cola del fago R4C. La estructura del tubo de la simulación SMD (0°) se sometió al servidor web modelo SMOG116 para generar el archivo del campo de fuerza. Las simulaciones MD se realizaron para 1,0 × 108 pasos de tiempo de duración 0,0005 unidades reducidas (50 ns en total) utilizando Gromacs (v4.6.7)117. Se utilizaron protocolos de Langevin Dynamics para garantizar una temperatura constante de 0,4 (unidades reducidas). Cada simulación MD basada en SMOG se repitió cinco veces.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan este estudio están disponibles a pedido de los autores correspondientes. Los mapas de densidad crio-EM se han depositado en el Banco de datos de microscopía electrónica (EMDB) con los códigos de acceso de EMD-34247 (cápside), EMD-34253 (vértice portal C1), EMD-34254 (vértice portal C5), EMD- 34250 (vértice del portal C12), EMD-34252 (terminador de tapón C6), EMD-34248 (tubo de cola), EMD-34249 (cola distal y placa base) y las coordenadas atómicas correspondientes se han depositado en el Banco de datos de proteínas (PDB). ) con los códigos de acceso de 8GTA (cápside), 8GTD (adaptador de portal C12), 8GTF (terminador de tapón C6), 8GTB (tubo de cola), 8GTC (cola distal y placa base). Las coordenadas atómicas de estructuras previamente determinadas están disponibles en el PDB bajo los siguientes códigos de acceso: 1OHG, 5WK1, 6TSU, 5LII, 5VF3, 6TB9, 6J3Q, 7VIK, 6XGQ, 6I9E, 6QVK, 5UU5, 5L35, 3JA7, 6QX5, 6IBG, 6QJT , 6TE8, 2KX4, 2KCA, 3F3B, 6TE9, 2LFP, 3FZ2, 6YQ5, 5W5F, 6TSV, 4JMQ, 6TEH, 2POH, 7BOZ, 7DVJ, 2LRP. Los datos de simulación de MD generados en este estudio se depositaron en la base de datos Zenodo OpenAIRE con el código de acceso 7947658. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvenciones n.º 42188102 y 91951209 a RZ, n.º 32170942 a QZ y n.º 81991491 a NX).

Estos autores contribuyeron igualmente: Yang Huang, Hui Sun, Shuzhen Wei.

Laboratorio Estatal Clave de Vacunología Molecular y Diagnóstico Molecular, Facultad de Salud Pública, Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad de Xiamen, Xiamen, 361102, China

Yang Huang, Hui Sun, Liqin Liu, Yanan Jiang, Jiabao Xin, Zhenqin Chen, Yuqiong Que, Zhibo Kong, Tingting Li, Hai Yu, Jun Zhang, Ying Gu, Qingbing Zheng, Shaowei Li y Ningshao Xia

Instituto Nacional de Diagnóstico y Desarrollo de Vacunas en Enfermedades Infecciosas, Universidad de Xiamen, Xiamen, 361102, China

Yang Huang, Hui Sun, Liqin Liu, Yanan Jiang, Jiabao Xin, Zhenqin Chen, Yuqiong Que, Zhibo Kong, Tingting Li, Hai Yu, Jun Zhang, Ying Gu, Qingbing Zheng, Shaowei Li y Ningshao Xia

Laboratorio Estatal Clave de Ciencias Ambientales Marinas, Laboratorio Clave de Secuestro de Carbono Marino de Fujian, Facultad de Ciencias Oceánicas y Terrestres, Universidad de Xiamen, Xiamen, 361102, China

Shuzhen Wei y Rui Zhang

Departamento de Ciencias Oceánicas, Universidad de Ciencia y Tecnología de Hong Kong, Hong Kong, China

Lanlan Cai

Instituto de Estudios Avanzados, Universidad de Shenzhen, Shenzhen, 518060, China

Rui Zhang

Unidad de Investigación de Tecnología de Frontera de Vacunología Estructural, Academia China de Ciencias Médicas, Xiamen, 361102, China

Ningshao Xiao

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QZ, SL, RZ y NX concibieron el proyecto. YH, HS y SW diseñaron los experimentos. YH, HS, SW, LC y JX realizaron los experimentos. LL, ZC e YJ recopilaron los datos crio-EM. YH, HS, QZ y SL determinaron las estructuras y realizaron figuras. YQ, ZK, TL, HY, JZ e YG participaron en la discusión e interpretación de los resultados. SL, QZ, RZ, YH, HS y SW escribieron el manuscrito. Todos los autores contribuyeron al análisis de datos y la preparación del manuscrito.

Correspondencia a Qingbing Zheng, Shaowei Li, Rui Zhang o Ningshao Xia.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Kazuyoshi Murata y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Huang, Y., Sun, H., Wei, S. et al. Estructura y mecanismo de entrega de ADN propuesto de un roseófago marino. Nat Comuna 14, 3609 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39220-y

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Recibido: 12 de septiembre de 2022

Aceptado: 02 de junio de 2023

Publicado: 17 de junio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39220-y

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